三七二醇對缺氧/復氧心肌細胞的保護機制及HSP70表達影響的研究△

李慶云（廣州市第一人民醫(yī)院老年病科　廣州　510180）

三七二醇對缺氧/復氧心肌細胞的保護機制及HSP70表達影響的研究△

李慶云（廣州市第一人民醫(yī)院老年病科廣州510180）

目的：探討三七二醇對缺氧/復氧心肌細胞的保護機制及HSP70表達的影響。方法：選擇剛出生的SD大鼠作心肌細胞原代培養(yǎng)及缺氧/復氧模型。將原代培養(yǎng)大鼠心肌細胞分為5組，A組為對照組；B組為缺氧/復氧對照組；C組為三七二醇低濃度組，D組為三七二醇中濃度組，E組為三七二醇高濃度組。用免疫組織化學法檢測HSP70的表達，用生化比色法檢測LDH活力。結果：三七二醇對SD大鼠缺氧/復氧心肌細胞具有明顯保護作用，保護作用與三七二醇濃度有關。隨著三七二醇濃度增加，缺氧/復氧心肌細胞HSP70表達增加，同時隨時間延長，SD大鼠缺氧/復氧損傷心肌細胞內(nèi)HSP70表達增加。結論：三七二醇對缺氧/復氧心肌細胞保護作用可能與HSP70表達增加有關。不同濃度的三七二醇對缺氧/復氧心肌細胞的保護均起一定作用。

三七二醇 缺氧/復氧 心肌細胞 熱休克蛋白70

三七二醇具有降低腦血管阻力，增加頸內(nèi)動脈血流量，抑制ADP、AA、PAF和凝血酶誘導的人體血小板聚集，降低血黏度和抑制血栓形成，改善微循環(huán)，改善腦缺血、腦梗塞引起的功能和行為障礙的功效。HSP70是熱休克蛋白中的一種，可被多種刺激誘導，它與心肌缺血/再灌注損傷的關系密切，被廣泛應用于心肌缺血再灌注損傷內(nèi)源性保護機制的研究。本研究選擇剛出生SD大鼠心肌細胞缺氧/復氧模型，觀察三七二醇對其保護作用及HSP70表達的影響。

1　材料和方法

1.1主要材料：選擇剛出生1～3d的SD大鼠乳鼠，雌雄不限。不同濃度的三七二醇皂苷。

1.2方法：原代心肌細胞培養(yǎng)：用改良Harary［1］方法制備乳鼠心肌細胞，進行原代培養(yǎng)，3d后用0.25%胰酶消化用于傳代。將蓋玻片置于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，接種1×105/孔，作細胞爬片。隔天換含20%無血清低糖的DMEM培養(yǎng)液，3d后用于實驗。

1.3心肌細胞模型的建立方法：正常對照組（C組）細胞不經(jīng)任何處理，持續(xù)培養(yǎng)50h。心肌細胞缺氧/復氧模型的制備主要參照Webester［2］方法進行。預先培養(yǎng)1h；去掉培養(yǎng)液，加入預先用N2飽和的D-Hankcs液，置于無菌密閉容器，在恒溫水浴箱內(nèi)保持37℃，進氣口通入95%N2+5%CO2混合氣體，經(jīng)出氣口流出，使容器內(nèi)保持無氧狀態(tài)2h；將D-Hankcs液換成含20%無血清低糖的DMEM培養(yǎng)液，將細胞放回37℃，5%CO2培養(yǎng)箱復氧，繼續(xù)培養(yǎng)48h。

1.4實驗分組：將原代培養(yǎng)大鼠心肌細胞分為5組，A組為對照組；B組為缺氧/復氧對照組；C組為三七二醇低濃度組，D組為三七二醇中濃度組，E組為三七二醇高濃度組。用免疫組織化學法檢測HSP70的表達，用生化比色法檢測LDH活力。

1.5統(tǒng)計學方法：使用SPSS11.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，根據(jù)實驗要求進行方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結　果

2.1三七二醇對缺氧/復氧心肌細胞LDH漏出的影響見表1。

表1　三七二醇對缺氧/復氧心肌細胞LDH漏出的影響（±s）

表1　三七二醇對缺氧/復氧心肌細胞LDH漏出的影響（±s）

組別　例數(shù)　LDH活力A B C D E 20 20 20 20 20 689.3±43.3 734.2±74.4*713.4±29.8☉634.5±57.7☉647.4±52.3☉

與I組比較，*P＜0.05；與II組比較，☉P＜0.05。

三七二醇對缺氧/復氧心肌細胞LDH漏出的影響與A組相比，心肌細胞在缺氧/復氧后LDH釋放明顯增加（P＜0.05），表明心肌細胞受到缺氧/復氧損傷。加入不同濃度的三七二醇后，心肌細胞缺氧/復氧損傷得到不同程度減輕，與B組相比C、D、E 組LDH釋放顯著減少（P＜0.05），高濃度三七二醇比低濃度三七二醇保護作用強。

2.2三七二醇對缺氧/復氧心肌細胞HSP70表達的影響：用顯微鏡觀察，不難看出正常心肌細胞HSP70表達量非常少，有的幾乎不表達；但缺氧/復氧損傷一旦發(fā)生，心肌細胞中HSP70表達增多（主要在胞漿內(nèi)表達）。不同的缺氧/復氧時間，HSP70表達不同，缺氧/復氧0h，細胞中HSP70表達很少，幾乎不表達。缺氧/復氧2h、4h、12h、24h，與A、B組相比，可見細胞中HSP70明增多。

3　討論

熱休克蛋白70（HSP70）具有促進細胞增殖、抗氧化損傷、分子伴侶［3］、細胞調節(jié)、ATP酶作用及參與細胞骨架的形成與修復等功能，尤其值得關注的是其具有的心肌保護作用和參與心肌細胞凋亡的調控［4］，能縮小心肌缺血壞死范圍、保護心肌收縮力、抗心律失常［5］。本研究發(fā)現(xiàn)三七二醇對SD大鼠缺氧/復氧心肌細胞具有明顯保護作用，保護作用與三七二醇濃度有關。隨著三七二醇濃度增加，缺氧/復氧心肌細胞HSP70表達增加，同時隨時間延長，SD大鼠缺氧/復氧損傷心肌細胞內(nèi)HSP70表達增加。不同濃度的三七二醇對缺氧/復氧心肌細胞的保護均起一定作用。

［1］Harary I，Barbara F.In vitrostudies of single isolated beatingheart cells［J］.Science，1960，31：1674-1657.

［2］Webester KW，Discher DJ，Bishopric NH.Cardioprotection in anin citro model of hypocic preconditioning［J］.J Mol Cell Cardiol，1995，27：453-458.

［3］Knowlton AA.The role of heat shock proteins in the heart［J］.Jmol Cell Cardiol，1995，27（1）：121-131.

［4］Suzuki k，Sawa Y，Kagisaki K，et al.Reductioninmyocardialapoptosis associated with overexpression of heat protein 70［J］. Basic Res Cardiol，2000，95：397-403.

［5］Gusarova V，Cap lan AJ，Brodsky JL，et al.Apoprotein B degradation is promoted by the molecularchaperonesHSP90andHSP70［J］.BiolChem，2001，276（27）：24891-24897.

△本文章是結題論文，項目編號：20121A011016。

R542.2+2

B

1672-8351（2016）02-0135-01