熱處理光滑念珠菌對(duì)大鼠氣道上皮細(xì)胞Dectin-1、IL-6和TNF-α表達(dá)的影響*

張　雪，駱雪萍△，白　劍，王玉春，吳呈霖，趙　瑩

(1.桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣西桂林 541100；2.桂林醫(yī)學(xué)院，廣西桂林 541004；3.桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西桂林 541100)

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·論著·

熱處理光滑念珠菌對(duì)大鼠氣道上皮細(xì)胞Dectin-1、IL-6和TNF-α表達(dá)的影響*

張雪1，駱雪萍1△，白劍2，王玉春3，吳呈霖1，趙瑩1

(1.桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣西桂林 541100；2.桂林醫(yī)學(xué)院，廣西桂林 541004；3.桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西桂林 541100)

目的探討大鼠氣道上皮(RTE)細(xì)胞與熱處理光滑念珠菌孵育后Dectin-1、IL-6和TNF-α的表達(dá)及意義。方法以體外培養(yǎng)的RTE細(xì)胞與熱處理光滑念珠菌孵育后分別于2、4、6 h觀察RTE細(xì)胞形態(tài)變化，以未與光滑念珠菌孵育的RTE細(xì)胞為對(duì)照組。用Western blot法檢測(cè)Dectin-1蛋白的表達(dá)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)IL-6和TNF-α mRNA的表達(dá)；ELISA法檢測(cè)上清液IL-6和TNF-α的分泌。結(jié)果隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，RTE細(xì)胞破壞逐漸加重及Dectin-1、IL-6和TNF-α 的表達(dá)呈進(jìn)行性增高。孵育2 h組與對(duì)照組比較、孵育4 h組與孵育2 h組比較、孵育6 h組與孵育4 h組比較，Dectin-1、IL-6和TNF-α 的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論RTE細(xì)胞具有天然免疫功能，其Dectin-1參與了對(duì)熱處理光滑念珠菌的識(shí)別，并激活I(lǐng)L-6和TNF-α的分泌，介導(dǎo)炎性反應(yīng)。IL-6起負(fù)性調(diào)節(jié)作用。

熱處理光滑念珠菌；Dectin-1受體；大鼠氣道上皮細(xì)胞；腫瘤壞死因子α；白細(xì)胞介素6

近年由于廣譜抗菌藥物、免疫抑制劑等的應(yīng)用，使侵襲性真菌感染(invasive fungal infection,IFI)的發(fā)病率增高，尤以重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)最多見(jiàn)[1]。ICU患者多以侵襲性肺部真菌感染(invasive pulmonary fungal infection,IPFI)最為常見(jiàn)，IPFI已成為導(dǎo)致重癥患者死亡的主要原因之一。以往IFI的病原菌以白色念珠菌為主，近年非白色念珠菌所占比例明顯增加，其中光滑念珠菌和熱帶念珠菌占較大比例，有報(bào)道光滑念珠菌幾乎成為ICU非白色念珠菌中首位致病菌[2]。本研究通過(guò)大鼠氣道上皮(rat tracheal epithelia，RTE)細(xì)胞與熱處理光滑念珠菌孵育，探討熱處理光滑念珠菌對(duì)RTE 細(xì)胞Dectin-1受體、IL-6和TNF-α表達(dá)的影響。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)RTE細(xì)胞購(gòu)于北京協(xié)和細(xì)胞資源中心。培養(yǎng)于DMEM F12 1∶1混合培養(yǎng)基中(含10%胎牛血清及青鏈霉素)。常規(guī)培養(yǎng)、傳代，培養(yǎng)條件37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱生長(zhǎng)。

1.2菌種標(biāo)準(zhǔn)光滑念珠菌，編號(hào)9627，購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。將光滑念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株接種于沙堡培養(yǎng)基，在37 ℃真菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，挑取菌落于高溫高壓滅菌PBS沖洗2次，配制成懸液，血球計(jì)數(shù)板倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)，1 200 rpm 4 ℃離心棄上清，用無(wú)菌PBS緩沖液重懸，于56 ℃環(huán)境下進(jìn)行熱處理30 min[3]，4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3RTE細(xì)胞與熱處理光滑念珠菌孵育實(shí)驗(yàn)

1.3.1孵育前細(xì)胞準(zhǔn)備棄培養(yǎng)基，PBS沖洗，棄PBS，胰酶消化，終止消化，離心，血球計(jì)數(shù)板倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至5×105/mL，每孔各取1 mL細(xì)胞懸液加入6孔板，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。

1.3.2孵育實(shí)驗(yàn)及分組稀釋光滑念珠菌液，計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度為5×106/mL，每孔加100 μL菌液，孵育復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)為1[4]。第1次向六孔板任意一孔加入菌液后，每隔2 h，分別再向其他六孔板任意一孔加入菌液，總共加菌液3次，分別標(biāo)記孵育6 h組、孵育4 h組和孵育2 h組。再?gòu)氖Ｓ嗫字须S機(jī)選取一孔，此標(biāo)記為對(duì)照組。

1.4Western blot檢測(cè)Dectin-1蛋白終止各組孵育，將細(xì)胞收集加入蛋白裂解液，離心提取上清液。應(yīng)用BCA定量法計(jì)算蛋白濃度。經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。TBS-T洗膜，封閉后，與一抗孵育，次日與二抗孵育。TBS-T洗膜后加入化學(xué)發(fā)光試劑，X線膠片曝光。應(yīng)用Image J軟件分析并計(jì)算各組條帶灰度值。

1.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)IL-6和TNF-α終止各組孵育，收集細(xì)胞加入1 mL Trizol，按照說(shuō)明書(shū)提取RNA。以2 μg總RNA為模板，按照說(shuō)明書(shū)配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，合成cDNA第一鏈。IL-6引物序列：上游5′-ACA GCG ATG ATG CAC TGT CA-3′，下游5′-ACG GAA CTC CAG AAG ACC AG-3′；TNF-α引物序列：上游5′-CAC CAC GCT CTT CTG TCT ACT-3′，下游5′-AGA TGA TCT GAG TGT GAG GGT C-3′；β-acting引物序列：上游5′-GGA GAT TAC TGC CCT GGC TCC TA-3′，下游5′-GAC TCA TCG TAC TCC TGC TTG CTG-3′。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min，94 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40循環(huán)。基因相對(duì)表達(dá)量以2-△△Ct表示。

1.6上清液ELISA檢測(cè)IL-6和TNF-α因子終止各組孵育，分別取100 μL共培養(yǎng)細(xì)胞上清液，按ELISA 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，繪制曲線，得出各組IL-6和TNF-α的表達(dá)濃度。

2　結(jié)　　果

2.14組RTE細(xì)胞光鏡觀察RTE細(xì)胞與熱處理光滑念珠菌孵育光鏡下見(jiàn)對(duì)照組RTE細(xì)胞形態(tài)清晰、完整；孵育2、4、6 h組可見(jiàn)RTE細(xì)胞形態(tài)不完整，邊緣模糊。孵育2 h 組與對(duì)照組比較、孵育4 h組與孵育2 h組比較、孵育6 h組與孵育4 h組比較，RTE細(xì)胞碎片及光滑念珠菌孢子逐漸增多。見(jiàn)圖1。

2.24組Dectin-1受體蛋白的表達(dá)及比較Western blot印跡見(jiàn)圖2。4組Dectin-1的表達(dá)見(jiàn)表1。孵育2 h組與對(duì)照組比較、孵育4 h組與孵育2 h組比較、孵育6 h組與孵育4 h組比較，Dectin-1蛋白的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A:對(duì)照組；B:孵育2 h組；C:孵育4 h組；D:孵育6 h組。

圖14組RTE細(xì)胞與熱處理光滑念珠菌孵育光鏡觀察(×20)

1：對(duì)照組；2：孵育2 h組；3：孵育4 h組；4：孵育6 h組。

圖2　　4組RTE細(xì)胞受體Dectin-1蛋白表達(dá) 表1　　4組Dectin-1蛋白的表達(dá)

a:P<0.05，與對(duì)照組比較;b:P<0.05，與孵育2 h組比較;c:P<0.05，與孵育4 h組比較。

2.34組IL-6和TNF-α mRNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果及比較實(shí)時(shí)熒光定量PCR(圖3～6)示待測(cè)基因的熒光信號(hào)真實(shí)可信。 RTE細(xì)胞與熱處理光滑念珠菌孵育后，4組IL-6和TNF-α mRNA的表達(dá)見(jiàn)圖7、8，表2、3。孵育2 h組與對(duì)照組比較、孵育4 h組與孵育2 h組比較、孵育6 h組與孵育4 h組比較，IL-6和TNF-α mRNA的表達(dá)均明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖3　　IL-6 mRNA擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線分析

圖4　　IL-6 mRNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線

圖5　　TNF-α mRNA擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線分析

圖6　　TNF-α mRNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線

圖7　4組RTE細(xì)胞中IL-6 mRNA 實(shí)時(shí)熒光定量PCR表達(dá)

圖8　4組RTE細(xì)胞中TNF-α mRNA實(shí)時(shí) 熒光定量PCR的表達(dá)表2　　4組IL-6 mRNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR的表達(dá)

組別IL-6mRNA對(duì)照組1.0000±0.00000孵育2h組1.6310±0.10742a孵育4h組2.1915±0.16894b孵育6h組3.5987±0.13098c

a:P<0.05，與對(duì)照組比較;b:P<0.05，與孵育2 h組比較;c:P<0.05，與孵育4 h組比較。

表3　　4組TNF-α mRNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR的表達(dá)

a:P<0.05，與對(duì)照組比較;b:P<0.05，與孵育2 h組比較；c:P<0.05，與孵育4 h組比較。

2.44組IL-6和TNF-α因子ELISA檢測(cè)的結(jié)果及比較ELISA顯示，孵育2 h組與對(duì)照組比較、孵育4 h組與2 h組比較，孵育6 h組與4 h組比較，IL-6和TNF-α的表達(dá)均顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表4、5。

表4　　4組上清液IL-6因子的表達(dá)

a:P<0.05，與對(duì)照組比較;b:P<0.05，與孵育2 h組比較;c:P<0.05，與孵育4 h組比較。

表5　　4組上清液TNF-α因子的表達(dá)

a:P<0.05，與對(duì)照組比較;b:P<0.05，與孵育2 h組比較;c:P<0.05，與孵育4 h組比較。

3　討　　論

當(dāng)真菌進(jìn)入呼吸道，首先接觸氣道上皮細(xì)胞。一般情況下當(dāng)纖毛清除系統(tǒng)有效運(yùn)行時(shí)真菌能被迅速清除。當(dāng)宿主免疫力低下、免疫狀態(tài)抑制或吸入真菌數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)氣道防御屏障清除能力時(shí)，真菌即可侵入機(jī)體導(dǎo)致真菌感染。此時(shí)，氣道上皮細(xì)胞的早期識(shí)別能力和免疫趨化等天然免疫功能顯得尤為重要。以往氣道上皮細(xì)胞僅被認(rèn)為起著機(jī)械物理屏障作用，但隨著深入研究發(fā)現(xiàn)氣道上皮細(xì)胞還是呼吸道應(yīng)對(duì)病原微生物感染產(chǎn)生免疫應(yīng)答的前哨細(xì)胞(sentinel cell)。更重要的是氣道上皮細(xì)胞可通過(guò)病原識(shí)別受體(pathogen recognition receptor，PRR)識(shí)別真菌并構(gòu)成強(qiáng)大的免疫屏障，從而成為抵抗真菌等病原微生物入侵機(jī)體的第一道防線[5]。

真菌侵入機(jī)體后，首先通過(guò)PRR對(duì)真菌表面病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular pattern，PAMP)進(jìn)行識(shí)別啟動(dòng)天然免疫。PRR是啟動(dòng)整個(gè)天然免疫應(yīng)答的樞紐[6]。真菌細(xì)胞壁任何成分都可能是潛在的 PAMP，位于細(xì)胞壁最內(nèi)層的β-葡聚糖是重要的PAMP。由于β-葡聚糖被甘露聚糖-甘露糖蛋白層覆蓋，從而阻止PRR對(duì)其的直接識(shí)別。當(dāng)細(xì)胞壁破壞時(shí)β-葡聚糖被釋放，宿主受體對(duì)暴露的β-葡聚糖碎片識(shí)別啟動(dòng)天然免疫。本研究發(fā)現(xiàn)隨著RTE細(xì)胞與熱處理光滑念珠菌孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，RTE細(xì)胞形態(tài)完整性逐漸破壞，細(xì)胞溶解、被吞噬現(xiàn)象越來(lái)越嚴(yán)重，細(xì)胞碎片逐漸增多，菌群數(shù)量不斷增多，甚至幾乎覆蓋全部RTE細(xì)胞。以上現(xiàn)象均提示熱處理的光滑念珠菌仍具有很強(qiáng)致病性，通過(guò)熱處理[3]可使光滑念珠菌細(xì)胞壁內(nèi)層的β-葡聚糖暴露，而暴露了的β-葡聚糖是光滑念珠菌致病的重要成分，這與本研究團(tuán)隊(duì)在大鼠整體實(shí)驗(yàn)中的研究結(jié)果一致[7]。

C型凝集素受體(C-type lectin receptors，CLR)是天然免疫中重要的PRR之一，CLR能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)[8]。CLR家族中的樹(shù)突狀細(xì)胞相關(guān)性Dectin-1與真菌感染密切相關(guān)，是識(shí)別真菌β-葡聚糖重要的PRR[9]。Dectin-1由胞外糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域(carbohydrate recognition domains，CRDs)、跨膜區(qū)域和細(xì)胞質(zhì)免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs，ITAM)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成[10]。正常情況下Dectin-1呈低表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示隨著RTE細(xì)胞與熱處理光滑念珠菌孵育時(shí)間延長(zhǎng)，Dectin-1的表達(dá)呈進(jìn)行性升高，具有時(shí)間依賴性。由此可見(jiàn)，RTE細(xì)胞不僅具有氣道的屏障功能，同時(shí)還有抗真菌的天然免疫功能，其Dectin-1是識(shí)別光滑念珠菌β-葡聚糖的重要PRR。

Dectin-1識(shí)別β-葡聚糖后還可誘發(fā)一系列的下游細(xì)胞因子的表達(dá)及炎性反應(yīng)。Li等[11]研究發(fā)現(xiàn)用白色念珠菌β-葡聚糖體外刺激人急性單核白血病細(xì)胞，能引起固有免疫反應(yīng)并使下游因子TNF-α、IL-6和IL-8表達(dá)增加。Gow等[3]研究也發(fā)現(xiàn)用人外周血單核細(xì)胞、鼠腹膜巨噬細(xì)胞分別與白色念珠菌孵育，熱處理組白念珠菌釋放更高的TNF-α、IL-6、IL-10和IFN-γ等因子。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣顯示RTE細(xì)胞與熱處理光滑念珠菌孵育后IL-6 和TNF-α mRNA的表達(dá)、IL-6 和TNF-α的分泌均隨孵育時(shí)間延長(zhǎng)而顯著上調(diào)，與Li等[11]和Gow等[3]用白色念珠菌β-葡聚糖與細(xì)胞孵育TNF-α和IL-6等因子表達(dá)水平明顯升高的研究結(jié)果一致。Leal等[12]研究發(fā)現(xiàn)敲除Dectin-1基因的小鼠真菌感染時(shí)IL-1β等細(xì)胞因子生成受阻，粒細(xì)胞浸潤(rùn)減少和菌絲清除能力下降，尤其是在高表達(dá)β-葡聚糖真菌感染時(shí)上述表現(xiàn)更明顯。然而，目前對(duì)于IL-6在真菌感染中發(fā)揮的作用尚未完全明確，甚至有爭(zhēng)議。傳統(tǒng)認(rèn)為在真菌感染期間，IL-6的分泌對(duì)于機(jī)體是起保護(hù)防御作用的。但近期研究[13]顯示，在真菌性血流感染中IL-6和TNF-α的分泌量與疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)隨著IL-6和TNF-α表達(dá)的進(jìn)行性增高，RTE細(xì)胞被侵蝕、溶解更加顯著，提示IL-6起了負(fù)性調(diào)節(jié)的作用，與真菌性血流感染的研究結(jié)果相似。由此可見(jiàn)，在真菌感染過(guò)程中，過(guò)強(qiáng)的免疫反應(yīng)及過(guò)度的免疫應(yīng)答會(huì)引起大量的炎性介質(zhì)釋放產(chǎn)生局部免疫損傷，這些對(duì)宿主自身是不利的。

綜上所述，具有氣道重要屏障功能的RTE細(xì)胞同樣具有抗真菌的天然免疫功能。RTE細(xì)胞的Dectin-1參與了對(duì)熱處理光滑念珠菌的識(shí)別，經(jīng)熱處理的光滑念珠菌仍具有較強(qiáng)的致病性，其暴露了的β-葡聚糖可直接作為PAMP被RTE細(xì)胞Dectin-1識(shí)別，并誘導(dǎo)下游細(xì)胞因子及炎性因子IL-6和TNF-α的表達(dá)。IL-6作為免疫反應(yīng)中的重要的細(xì)胞因子在RTE細(xì)胞光滑念珠菌感染中起到了負(fù)性調(diào)節(jié)作用。因此，充分認(rèn)識(shí)Dectin-1及IL-6可能在免疫學(xué)方面為臨床抗真菌治療提供一個(gè)新的靶點(diǎn)。

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Effects of heat-treated candida glabrata on the expression of Dectin-1,the production of IL-6 and TNF-α in rat tracheal epithelial cells*

ZhangXue1,LuoXueping1△,BaiJian2,WangYuchun3,WuChenglin1,ZhaoYing1

(1.DepartmentofICU,theSecondAffiliatedHospitalofGuilinMedicalCollege,Guilin,Guangxi541100,China;2.GuilinMedicalCollege,Guilin,Guangxi541004,China;3.DepartmentofClinicalLaboratory,theSecondAffiliatedHospitalofGuilinMedicalCollege,Guilin,Guangxi541100,China)

ObjectiveTo explore the effects of co-cultured heat-treated candida glabrata with rat tracheal epithelial (RTE) cells on the expression of Dectin-1 and the production of IL-6 and TNF-α.MethodsRTE cells in vitro were co-cultured with heat-treated candida glabrata bacteria liquid for 2,4,6 h,while without co-cultured RTE cells were used as control group.We observed the morphological changes of RTE cells,detected the protein expressions of Dectin-1 by Western blot,used real-time PCR to detecte the mRNA expressions of IL-6 and TNF-α and measured protein expression of IL-6 and TNF-α by ELISA．ResultsWith the passing of time,the RTE cells were damaged extensively and the expression of Dectin-1,IL-6 and TNF-α became more and more significant.Obviously,there had significant difference in the expression of Dectin-1,IL-6 and TNF-α between the co-cultured 2 h group and the control group,the co-cultured 4 h group and the co-cultured 2 h group,the co-cultured 6 h group and the co-cultured 4 h group (P<0.05).ConclusionRTE cells have natural immune function.The Dectin-1 involves in the recognition of heat-treated Candida glabrata,activating secretion of IL-6 and TNF-α and mediating inflammatory reaction.IL-6 plays a negative regulation role.

heat-treated candida glabrata；Dectin-1 receptor；rat tracheal epithelial cells；tumor necrosis factor-α；interleukins-6

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.07.001

廣西醫(yī)療衛(wèi)生重點(diǎn)科研課題(重2012007)；廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2013GXNSFAA019209)。作者簡(jiǎn)介：張雪(1987-)，住院醫(yī)師，碩士，主要從事重癥感染方面的研究。△

，E-mail:xueping-l@sohu.com。

R519

A

1671-8348(2016)07-0865-04

2015-09-14

2015-11-26)