生理性深層海水聯(lián)合熱療治療肝細胞癌的體外抑瘤研究*

代佑果,李為明,唐輝蓉,姚　乾,崔　進△

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院/云南省腫瘤醫(yī)院，昆明 650118；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，昆明 650101)

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論著·臨床研究

生理性深層海水聯(lián)合熱療治療肝細胞癌的體外抑瘤研究*

代佑果1,李為明2,唐輝蓉2,姚乾1,崔進2△

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院/云南省腫瘤醫(yī)院，昆明 650118；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，昆明 650101)

目的探討生理性深層海水(PDSW)聯(lián)合熱療對肝細胞癌的體外抑瘤作用。方法將取自我國海南省海域的深層海水進行制備，制成PDSW，檢測所含有的部分元素。體外培養(yǎng)的正常肝細胞和人肝癌QGY-7703細胞被隨機分為PDSW組和生理鹽水組，PDSW組加入PDSW，生理鹽水組給予等量生理鹽水，24 h后，每天分別接受40 ℃熱療6 h和43 ℃熱療1 h，在熱療后的24、48、72 h，用MTT法檢測熱療結(jié)合PDSW對正常肝細胞及人肝癌QGY-7703細胞的抑制率。同時檢測PDSW及生理鹽水在40 ℃ 6 h連續(xù)10 d狀態(tài)下對人肝癌QGY-7703細胞克隆形成率的影響。結(jié)果MTT檢測結(jié)果顯示腫瘤抑制率在兩組均呈時間和濃度依賴性。PDSW組的腫瘤抑制率明顯較生理鹽水組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。PDSW組對正常肝細胞的生長抑制率明顯低于生理鹽水組。此外，PDSW組的腫瘤細胞克隆形成率較生理鹽水組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論PDSW能夠提高正常肝細胞對熱的耐受性。當聯(lián)合熱療時，可明顯抑制人肝癌QGY-7703細胞生長。

癌，肝細胞；生理性深層海水；熱療；耐受力

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1深層海水取自海南省瓊海市海域，海平面200 m以下，避光運至昆明，室溫避光儲存。在0.3 MPa壓力下，經(jīng)5.00 μm、1.00 μm聚丙烯熔噴PP棉超微過濾后，用銅鋅合金(KDF)除去海水中的重金屬，反復(fù)凍融方法濃縮并去除海水中多余的鹽分濃縮海水，0.01 μm PVC合金超濾膜除細菌、部分病毒和微小雜質(zhì)，活性炭吸附異味，電感耦合等離體質(zhì)鐠(ICP-MS)多次檢測PDSW中部分元素的含量后，制備成PDSW備用。

1.1.2細胞株人肝癌QGY-7703細胞株由云南省腫瘤研究所提供。正常肝細胞由云南省腫瘤研究所提供。

1.1.3主要試劑RPMI1640培養(yǎng)基為美國Gibco公司產(chǎn)品；新生小牛血清為美國Costar公司產(chǎn)品；十二烷基硫酸鈉(SDS)、二甲基酰胺(DMF)和乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)為上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品；MTT：美國Amresco公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1細胞抑制率檢測(改良MTT比色法)取對數(shù)生長期的腫瘤細胞株及正常肝細胞株經(jīng)0.25%胰酶消化，調(diào)細胞濃度為2×105個/mL接種于96孔板，培養(yǎng)24 h。然后進行分組,每組設(shè)6個平行孔，其中空白對照組:只加培養(yǎng)基；對照組:培養(yǎng)細胞，不加藥；試驗組：海水終濃度梯度為100%(即PDSW)、50.00%、25.00%、12.50%、8.33%、6.25%；陽性對照組：鹽水終濃度梯度為0.90%、0.45%。上述各組再根據(jù)熱療溫度不同設(shè)37 ℃、40 ℃及43 ℃ 3個組，每組根據(jù)熱療時間(次數(shù))再分為24 h(熱療1次)、48 h(熱療2次)、72 h(熱療3次)3個組。熱療：其中一組每天把培養(yǎng)箱的溫度提高到40 ℃，持續(xù)6 h后，再把培養(yǎng)箱的溫度恢復(fù)到37 ℃；另一組每天把培養(yǎng)箱的溫度提高到43 ℃，持續(xù)1 h后，再把培養(yǎng)箱的溫度恢復(fù)到37 ℃。37 ℃組按常規(guī)進行細胞培養(yǎng)法培養(yǎng)。終止熱療作用：分別在熱療后的24、48、72 h每孔加入5 mg/mL的MTT 20.00 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。各孔加入20% SDS 50% DMF裂解液溶解甲瓚結(jié)晶，震蕩后過夜。用酶標儀于580 nm測定光密度(OD)值，以O(shè)D值表示細胞增殖情況。

1.2.2癌細胞克隆形成率檢測每試驗點設(shè)3復(fù)孔(24孔板)，每孔接種2×102個人肝癌QGY-7703細胞，24 h后分別加入生理鹽水(NS)或PDSW。每3天換液。連續(xù)觀察7～10 d，計數(shù)各孔克隆數(shù)(細胞數(shù)大于或等于50判定為克隆)。克隆形成率(%)=克隆數(shù)目/接種細胞數(shù)×100%，計算各孔克隆形成率。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以（±s）表示，多組間對比采用單因素方差分析，兩兩對比采用q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)　　果

2.1加PDSW或NS進行37 ℃常規(guī)培養(yǎng)對正常肝細胞增殖的抑制作用 37 ℃正常培養(yǎng)狀態(tài)下，加PDSW或NS對正常肝細胞均沒有明顯的抑制作用，24、48、72 h各時段兩組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。

圖1　37 ℃常規(guī)培養(yǎng)時，加PDSW或NS對正常肝 細胞增殖的抑制率

2.2加PDSW或NS分別進行40 ℃ 6 h或43 ℃ 1 h熱療對正常肝細胞增殖的平均抑制率40 ℃ 6 h或43 ℃ 1 h加NS或PDSW對正常肝細胞增殖的平均抑制率均呈時間依賴性(圖2)，即隨著熱療時間延長，抑制率也隨著增加；且加NS的抑制率較加PDSW者明顯。

2.3同一溫度下，PDSW組及NS組對正常肝細胞增殖的抑制率在同一溫度(40 ℃或43 ℃)下，各時間點，PDSW組對正常肝細胞增殖的抑制率均較NS組小(P<0.05)。就PDSW組來說，40 ℃ 6 h與43 ℃ 1 h比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

2.4同一時間、同一溫度，不同濃度海水對正常肝細胞增殖的抑制率同一時間(24、48、72 h)、同一溫度(40 ℃或43 ℃)熱療時，各組隨著海水濃度增加，抑制率增強，呈現(xiàn)出濃度依賴的特點，即隨著海水濃度增大，PDSW加熱療對正常肝細胞增殖的抑制率增強。未被稀釋的PDSW(即海水原液：硬度為3 000 ppm的深層海水)組的抑制率最強，見圖4。

圖2　不同時間、不同溫度，加PDSW和NS對 正常肝細胞增殖的抑制率

圖3　同一溫度下，PDSW組及NS組對正常 肝細胞增殖的抑制率

圖4　同一時間、同一溫度，不同濃度海水對正常 肝細胞增殖的抑制率

2.5同一時間、同一溫度下，加NS與PDSW(海水原液)對正常肝細胞增殖的影響同一時間(24、48、72 h)、同一溫度(40 ℃或43 ℃)下，在體外，PDSW加熱療對正常肝細胞增殖的抑制率均低于NS(P<0.05)，見圖5。

圖5　同一時間、同一溫度下，加NS與PDSW 對正常肝細胞增殖的抑制率

2.6加PDSW或NS進行37 ℃常規(guī)培養(yǎng)對人肝癌QGY-7703細胞增殖的抑制作用在37 ℃正常培養(yǎng)狀態(tài)下，加PDSW對人肝癌QGY-7703細胞增殖有明顯的抑制作用，24、48、72 h各時段與NS組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖6。

圖6　37 ℃常規(guī)培養(yǎng)時，加PDSW或NS對人肝癌 QGY-7703細胞增殖的抑制率

2.7加PDSW或NS分別進行40 ℃ 6 h或43 ℃ 1 h熱療對人肝癌QGY-7703細胞增殖的平均抑制率40 ℃ 6 h或43 ℃ 1 h加NS或PDSW對人肝癌QGY-7703細胞增殖的平均抑制率呈時間依賴性(圖7)，即隨著熱療時間延長，抑制率也隨著增加；且PDSW組的抑制率較NS組明顯。

圖7　不同時間、不同溫度，加NS和PDSW對人肝癌 QGY-7703細胞增殖的抑制率

2.840 ℃ 6 h與43 ℃ 1 h熱療比較，加NS組或PDSW組的各時段對體外培養(yǎng)的人肝癌QGY-7703細胞增殖的影響40 ℃ 6 h與43 ℃ 1 h熱療比較，加NS組或PDSW組的各時段的抑制率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖8。

圖8　40 ℃ 6 h與43 ℃ 1 h熱療比較，加NS組 或PDSW組的各時段對體外培養(yǎng)的人肝癌 QGY-7703細胞增殖的抑制率

2.9同一時間、同一溫度，不同濃度的深層海水對人肝癌QGY-7703細胞增殖的抑制率同一時間(24、48、72 h)、同一溫度(40 ℃或43 ℃)熱療時，各組隨著海水濃度增加，抑制率增強，呈現(xiàn)出濃度依賴的特點，即隨著海水濃度增大，PDSW加熱療對人肝癌QGY-7703細胞增殖的抑制率增強。PDSW(即海水原液)組的抑制率最強，見圖9。

2.10同一時間、同一溫度下，加NS與PDSW(海水原液)對人肝癌QGY-7703細胞增殖的影響同一時間(24、48、72 h)、同一溫度(40 ℃或43 ℃)下，在體外，PDSW加熱療對人肝癌QGY-7703細胞增殖的抑制率均高于NS加熱療(P<0.05)，見圖10。

圖9　同一時間、同一溫度，不同濃度海水對人肝癌 QGY-7703細胞增殖的抑制率

圖10　同一時間、同一溫度下，加NS與PDSW對人肝癌 QGY-7703細胞增殖的抑制率

2.11同一時間、同一溫度，加PDSW對正常肝細胞和人肝癌QGY-7703細胞增殖的影響從總體上看，PDSW加40 ℃ 6 h或43 ℃ 1 h熱療在24、48、72 h均可以對肝癌QGY-7703細胞起到較好的抑制作用，同時對正常肝細胞產(chǎn)生較小的影響，見圖11。

圖11　同一時間、同一溫度，加海水對正常肝細胞和人肝癌 QGY-7703細胞增殖的抑制率

2.12PDSW對人肝癌QGY-7703細胞克隆形成率的抑制作用經(jīng)過10 d培養(yǎng)，PDSW組人肝癌QGY-7703細胞克隆形成較少(圖12A)，而在NS克隆形成明顯(圖12B)。進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，40 ℃ 6 h熱療10 d后各組克隆形成率比較，PDSW組的克隆率明顯較NS組少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

A:NS組；B：PDSW組。

圖12　加NS或PDSW 40 ℃ 6 h熱療10 d后，人肝癌 QGY-7703細胞克隆形成情況 表1　　40 ℃ 6 h熱療10 d后兩組各培養(yǎng)孔 腫瘤細胞克隆形成率(n=3)

3　討　　論

原發(fā)性肝癌是我國比較常見的惡性腫瘤,其惡性程度較高,起病隱匿,早期多無明顯癥狀，一旦發(fā)現(xiàn),大多已屬中晚期,目前缺乏有效的治療藥物。因而,為中晚期原發(fā)性肝癌患者尋找行之有效的治療方法已成為醫(yī)療界最緊迫的任務(wù)之一。熱療可以抑制腫瘤血管形成及促進癌細胞凋亡[3]，正逐漸成為一種有希望的肝癌治療手段。

體外實驗研究發(fā)現(xiàn)，細胞的生存率會隨著加熱的溫度和時間而變化,溫度越高、作用時間越長，療效將呈指數(shù)性遞增[4-5]。根據(jù)癌細胞對熱的臨界溫度(或稱為閾溫度)不同，熱可以發(fā)揮兩方面的作用，在閾溫度以下熱誘導(dǎo)細胞凋亡為熱作用的主要機制,而閾溫度以上則主要引起細胞壞死,細胞損傷程度呈指數(shù)性遞增[6-7]。細胞株的種類不同，閾溫度也不一樣,差異頗大,一般認為大多數(shù)細胞株的臨界溫度介于42.5～43.0 ℃。本試驗發(fā)現(xiàn)，在同一組別(NS組或PDSW組)，40 ℃ 6 h的熱療對人肝癌QGY-7703細胞的抑制率與43 ℃ 1 h比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明提高熱療的溫度或延長作用時間，均可增加熱療的細胞毒作用，從而可為溫和熱療[平臺期生物體核心溫度(39.8±0.2)℃，恒溫期6 h]治療腫瘤奠定基礎(chǔ)，在溫和熱療作用下，隨著治療時間延長，可以達到高溫?zé)岑熗瑯拥男Ч?/p>

內(nèi)環(huán)境的維持靠各種微量元素的平衡，只有在穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境下，機體的功能才能正常發(fā)揮。海水是為人類提供“平衡微量元素”的最好資源[7]。與表層海水比較，深層海水具有以下特點：低溫、潔凈性、富含平衡易吸收的微量元素、氧化還原水、pH值呈弱堿性[8]。飲用深層海水可糾正元素異常，恢復(fù)患者的鈣(Ca)/鎂(Mg)比例，以及鋁(Lv)、汞(Hg)和鉛(Pb)水平[9]。長期飲用深層海水可促進機體的元素平衡，如其中的鈉(Na)和鉀(K)均衡有助于維持機體的酸堿平衡[10]；Ca和Mg比例的適當對調(diào)節(jié)脂代謝及維持心血管系統(tǒng)的正常功能尤為重要[11-12]。在本試驗中發(fā)現(xiàn)，加入PDSW，正常肝細胞對熱的臨界溫度提高，耐熱能力增強，而肝癌QGY-7703細胞的臨界溫度相反降低，耐熱能力降低。推測由于癌細胞結(jié)構(gòu)異常(如Na+-K+ATP等異常)，即使在給予平衡元素的基礎(chǔ)上也難以糾正自身的元素失衡，造成對熱耐受力降低，相關(guān)機制需要進一步研究。

此外，深層海水具有直接抑制腫瘤侵襲或轉(zhuǎn)移的作用，Kim等[13]的研究表明PDSW對乳腺癌的侵襲/轉(zhuǎn)移具有抑制作用，由此認為PDSW通過預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移，有望改善癌癥患者的生存。本研究發(fā)現(xiàn)在37 ℃正常培養(yǎng)狀態(tài)下，PDSW對體外培養(yǎng)的人肝癌QGY-7703細胞的增殖能力具有明顯的抑制作用，且這種抑制具有時間及濃度依賴的特點，其抑制機制推測可能與Kim等報道的結(jié)果類似，相關(guān)研究有待進一步深入。

總之，本研究結(jié)果表明PDSW能夠提高正常肝細胞對熱的耐受性。在正常體溫(37 ℃)狀態(tài)下，PDSW對體外培養(yǎng)的人肝癌QGY-7703細胞的增殖能力具有明顯的抑制作用。當與熱療聯(lián)合使用時，PDSW能夠改變癌細胞對熱的臨界溫度，增加熱療的抗癌效果，相關(guān)機制需要更多研究支持。

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The anti-cancer effects of physiological deep-sea water combined with hyperthermia for hepatocellular carcinoma in vitro*

DaiYouguo1,LiWeiming2,TangHuirong2,YaoQian1,CuiJin2△

(1.theThirdAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity/TumorHospitalofYunnanProvince,Kunming,Yunnan650118,China;2.theSecondAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650101,China)

ObjectiveTo explore the anti-cancer effects of physiological deep-sea water(PDSW) combined with hyperthermia for hepatocellular carcinoma in vitro.MethodsDeep-sea water (DSW) from the south Chinese sea was processed,and made into PDSW,detection of some elements.In vitro,the cultured normal liver cells and human hepatoma QGY-7703 cells were randomly divided into PDSW group and normal saline(NS) group,the NS group received saline,the PDSW group received different concentrations of PDSW.Two groups were heated respectively to 6 h of 40 ℃ or 1 h of 43 ℃，24,48,72 h after the administration of PDSW or saline,the normal liver cells and QGY-7703 cells proliferation capacity and toxicity were investigated by MTT assay.At the same time testing PDSW and NS in 40 ℃ 6 h for 10 d state of human liver QGY-7703 cell clone formation rate.ResultsThe results of MTT assay showed that tumor inhibitory rate were time and concentration dependent in tow groups.Tumor inhibitory rate of PDSW group in different time was significantly higher than NS group (P<0.05).On the other hand,the inhibitory of hepatocyte for PDSW group in different time were significantly lower than NS group.In addition,the clone formation rate of PDSW group was lower than those of NS group(P<0.05).ConclusionPDSW can improve the heat tolerance of normal liver cells.When combine with heat,it can obviously inhibit the growth of human liver cancer QGY-7703 cells.

carcinoma，hepatocellular;deep-sea water;hyperthermia;tolerance

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.07.011

云南省科技廳-昆明醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合專項基金資助項目(2010CD166)。作者簡介：代佑果(1978-)，副教授，博士，主要從事肝癌的基礎(chǔ)與臨床研究?！?/p>

，E-mail:yncuijin@126.com。

R282.77

A

1671-8348(2016)07-0899-04

2015-09-08

2015-11-22)