淋巴細(xì)胞亞群及血細(xì)胞抗體檢測(cè)在再生障礙性貧血中的臨床意義*

高澤莉，汪宏云，葉　梅，李　莉，周　麗，郭　峰

(四川省攀枝花學(xué)院附屬醫(yī)院血液科　617000)

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淋巴細(xì)胞亞群及血細(xì)胞抗體檢測(cè)在再生障礙性貧血中的臨床意義*

高澤莉，汪宏云，葉梅，李莉，周麗，郭峰

(四川省攀枝花學(xué)院附屬醫(yī)院血液科617000)

目的探討再生障礙性貧血患者外周血淋巴細(xì)胞亞群及血細(xì)胞抗體水平的變化及臨床意義。方法采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)25例再生障礙性貧血患者(重型再生障礙性貧血7例，非重型再生障礙性貧血18例)及20例健康志愿者(對(duì)照)外周血淋巴細(xì)胞亞群(CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+/CD8+、CD3-CD19+、CD3-CD16+CD56+)及血細(xì)胞抗體(抗血小板抗體、抗紅細(xì)胞抗體及抗粒細(xì)胞抗體)。結(jié)果再生障礙性貧血組患者CD4+T淋巴細(xì)胞百分比、CD4/CD8比值，CD56+百分比明顯降低(P<0.05)；血細(xì)胞抗體(血小板抗體、紅細(xì)胞抗體、粒細(xì)胞抗體)陽性率明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論再生障礙性貧血患者細(xì)胞免疫功能異常，同時(shí)血細(xì)胞膜上抗體陽性率高，提示體液免疫也存在異常。

再生障礙性貧血；淋巴細(xì)胞亞群；血細(xì)胞抗體

再生障礙性貧血(aplastic anemia，AA)是一類主要由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)造血組織損傷而導(dǎo)致的骨髓造血衰竭綜合征。近年來，越來越多研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞免疫是其主要發(fā)病機(jī)制，包括Th/Ts細(xì)胞失衡及CD8+T細(xì)胞過度活化、Treg細(xì)胞的明顯降低等有關(guān)。目前，細(xì)胞免疫功能T淋巴細(xì)胞亞群的研究較多，但對(duì)AA患者血細(xì)胞抗體的研究卻很少。本研究應(yīng)用流式細(xì)胞儀對(duì)25例AA患者的外周血淋巴細(xì)胞亞群及血細(xì)胞抗體進(jìn)行了檢測(cè)，旨在觀察二者在AA發(fā)病中的變化及臨床意義，以便指導(dǎo)治療及病情觀察。

1　資料與方法

1.1一般資料全部AA病例均為本院住院或門診患者，根據(jù)血常規(guī)和骨髓檢查及骨髓活檢確診，符合張之南《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》。將研究對(duì)象分為兩組，AA組：男13例，女12例；重型AA 患者7例，非重型AA患者18例；年齡4～68歲，中位年齡35歲；(2)健康志愿者(對(duì)照組)：男11例，女9例，中位年齡32歲。主要試劑及儀器：流式細(xì)胞儀為美國貝克曼五色流式細(xì)胞儀，淋巴細(xì)胞亞群試劑盒及血細(xì)胞抗體試劑盒(Beckman公司,America)。試劑為鼠抗人單克隆抗體，溶血素為全血溶血試劑，為BEKMAN COULT A11895。

1.2方法

1.2.1淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)方法采集外周靜脈血3 mL，乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)，包括CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+/CD8+、CD3-CD19+、CD3-CD16+CD56+等。直接免疫熒光法：熒光素標(biāo)記的各種單克隆抗體加入到全血中，與白細(xì)胞膜上相應(yīng)的抗原結(jié)合，經(jīng)過熒光標(biāo)記固定、溶血步驟后，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析，從而得到淋巴細(xì)胞亞群的百分?jǐn)?shù)，加入Flow-Count即可得出絕對(duì)計(jì)數(shù)。

1.2.2血細(xì)胞抗體檢測(cè)方法采集外周靜脈血3 mL，EDTA-K2抗凝后，直接免疫熒光法。FITC標(biāo)記的各型單克隆抗體，加到全血樣本中，與粒細(xì)胞膜、血小板膜、紅細(xì)胞膜上的相應(yīng)的IgG-Fc片段結(jié)合，經(jīng)過洗滌(和固定)等步驟后，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析，報(bào)告百分?jǐn)?shù)。

2　結(jié)　　果

2.1AA組與對(duì)照組淋巴細(xì)胞亞群的比較AA組CD3+平均值(70.00±12.25)%，與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，AA組CD4+T淋巴細(xì)胞平均值為(32.50±5.61)%，明顯低于對(duì)照組(P<0.05);CD8+平均值為(39.70±5.02)%，明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，CD4/CD8比值，平均值為(0.90±0.26)%，與對(duì)照組比明顯降低(P<0.05)，CD56+平均值(7.94±4.51)%,明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，見表1。

2.2AA組與對(duì)照組外周血血細(xì)胞抗體的比較血小板抗體PAIGG平均值(2.30±1.94)%，明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，

表1　　AA組與對(duì)照組淋巴細(xì)胞亞群的比較±s)

表2　　AA組與對(duì)照組血細(xì)胞抗體的比較±s)

血小板抗體PAIGA平均值(2.22±2.09)%，明顯高于對(duì)照組(P<0.05),血小板抗體PAIGM平均值(8.27±9.93)%，明顯高于對(duì)照組。紅細(xì)胞抗體IGG(0.40±0.23)%,明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，紅細(xì)胞抗體IGA(1.17±1.76)%,與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，紅細(xì)胞抗體IGM平均值(2.25±1.60)%，明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，粒細(xì)胞抗體IGG平均值(1.86±1.20)%，，明顯高于對(duì)照組(P<0.05),粒細(xì)胞抗體IGA平均值(3.38±5.26)%，與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),粒細(xì)胞抗體IGM平均值(5.16±6.82)%，明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，見表2。

3　討　　論

傳統(tǒng)學(xué)說認(rèn)為AA是原發(fā)、繼發(fā)干細(xì)胞缺陷、造血微環(huán)境異常及免疫異常3種機(jī)制導(dǎo)致的骨髓造血功能衰竭。目前，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為AA患者的發(fā)病機(jī)制為T細(xì)胞功能異常、細(xì)胞免疫亢進(jìn)并以骨髓為靶器官的自身免疫性疾病。其T細(xì)胞亞群失衡、CD8比例增高、CD4/CD8比例倒置[1-2]。

本研究表明AA患者總T細(xì)胞與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但CD4/CD8比值異常，主要見于重型AA，而非重型AA的CD4/CD8多正常。

CD19是B細(xì)胞標(biāo)志之一，本研究表明，AA中B細(xì)胞數(shù)量下降有6個(gè)，B淋巴細(xì)胞的數(shù)量增加的有3個(gè)，B細(xì)胞數(shù)量變化與血細(xì)胞抗體改變不一致，B細(xì)胞數(shù)量增加或減少的患者都有血細(xì)胞抗體的高表達(dá)。提示AA患者可能存在B細(xì)胞功能異常，體液免疫在AA發(fā)病機(jī)制中的作用尚無定論。目前，已陸續(xù)有文獻(xiàn)提及體液免疫在AA發(fā)病機(jī)制中的作用，可能仍有一定的體液免疫參與。但并不是直接參與，也可能不是原發(fā)因素而是繼發(fā)效應(yīng)所致。也有研究報(bào)道是通過表達(dá)協(xié)同刺激分子途徑或調(diào)節(jié)性T細(xì)胞途徑影響AA患者T淋巴細(xì)胞活化[3]。

CD16+56+是NK細(xì)胞的特性標(biāo)志，參與腫瘤、感染、免疫調(diào)節(jié)。本研究發(fā)現(xiàn)AA患者NK+減少的有6例，均為重型AA，說明AA患者NK細(xì)胞免疫功能明顯受損的。較多文獻(xiàn)提及NK細(xì)胞在AA患者中數(shù)量是減低的，NK細(xì)胞表面同時(shí)存在抑制性受體和活化性受體，但抑制性受體居主導(dǎo)地位，表現(xiàn)為NK細(xì)胞對(duì)自身正常組織細(xì)胞不產(chǎn)生殺傷作用，NK細(xì)胞的降低減弱了T淋巴細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，導(dǎo)致免疫功能失衡。在Fas缺陷的小鼠模型中，NK細(xì)胞在體外可以抑制自身反應(yīng)性B淋巴細(xì)胞，而在體內(nèi)將NK細(xì)胞清除后則會(huì)加重自身免疫性疾病的程度[4-8]，提示NK細(xì)胞減少在AA發(fā)病機(jī)制中起一定作用。

本研究同時(shí)進(jìn)行了成熟血細(xì)胞抗體的測(cè)定。紅、粒細(xì)胞抗體包括IGG、IGM、IGA，血小板抗體包括PAIGG、PAIGA、PAIGM。成熟血細(xì)胞抗體測(cè)定目前較少文獻(xiàn)提及。劉惠等[9]研究較多的為免疫相關(guān)性血細(xì)胞減少(immuno-related hemocytopenia，IRH)，此病為自身抗體損傷和(或)抑制骨髓不成熟造血細(xì)胞導(dǎo)致的造血功能低下，骨髓造血細(xì)胞自身抗體是由T淋巴細(xì)胞調(diào)控失衡導(dǎo)致B淋巴細(xì)胞數(shù)量/亞群/功能異常，進(jìn)而產(chǎn)生的一類抗體。劉惠等[9]對(duì)此病的擬診標(biāo)準(zhǔn)：(1)兩系或全血細(xì)胞減少，網(wǎng)織紅細(xì)胞比例不低，骨髓中紅系比例正常或偏高，易見紅系造血島及紅細(xì)胞吞噬現(xiàn)象；(2)除外其他原發(fā)或繼發(fā)血細(xì)胞減少癥如AA、MDS、PNH相鑒別。其確診標(biāo)準(zhǔn)為FCM檢測(cè)到骨髓造血細(xì)胞膜自身抗體即可確診(治療前確診)，若未檢測(cè)到骨髓未成熟造血細(xì)胞膜上自身抗體，但對(duì)激素、靜脈用丙球蛋白等免疫抑制劑有效仍可確診[8-9]。

作者沒有檢測(cè)干祖細(xì)胞抗體，而是檢測(cè)外周血成熟血細(xì)胞抗體。本研究發(fā)現(xiàn)，AA患者血細(xì)胞抗體均為陽性5/25(20%)，紅細(xì)胞抗體陽性6/25(24%)，粒細(xì)胞抗體陽性9/25(36%)，血小板抗體陽性10/25(40%)。與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，尤其以IGM型血細(xì)胞抗體為主，提示AA患者也存在體液免疫的異常。自身抗體針對(duì)骨髓造血細(xì)胞膜上何種抗原，這些抗原如何被遞呈并激活TH2細(xì)胞，目前文獻(xiàn)不多，還有待進(jìn)一步研究。付蓉等[10]發(fā)現(xiàn)部分IRH患者自身抗體可作用于骨髓紅系造血細(xì)胞膜上的促紅細(xì)胞生成素受體(EPOR)，封閉EPOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致紅系較早階段增殖和分化受抑，EPOR可能為自身抗體作用的靶點(diǎn)之一。血細(xì)胞抗體陽性的AA患者如何與IRH鑒別？AA是一種以骨髓造血組織為靶器官，T細(xì)胞免疫功能亢進(jìn)的自身免疫性疾病，為細(xì)胞免疫亢進(jìn)，血常規(guī)網(wǎng)織紅細(xì)胞及中性粒細(xì)胞百分比明顯降低，淋巴細(xì)胞比例升高，骨髓減低或重度減低。而IRH為體液免疫亢進(jìn)，B淋巴細(xì)胞比例超過正常，而且亞群失衡，特別是CD5+B淋巴細(xì)胞明顯多于健康者及AA患者，IGg1及IGg3水平增高，血常規(guī)網(wǎng)織紅細(xì)胞及中性粒細(xì)胞百分比不低，巨核細(xì)胞不少，骨髓易見紅系造血島或嗜血現(xiàn)象，對(duì)糖皮質(zhì)激素及靜脈用丙球蛋白療效好，起效快[11]。

淋巴細(xì)胞亞群聯(lián)合血細(xì)胞抗體的測(cè)定，不僅可以幫助探討AA的發(fā)病機(jī)制，也可以指導(dǎo)臨床用藥，組內(nèi)2例AA患者，血象及骨髓象恢復(fù)后，復(fù)查淋巴細(xì)胞亞群及血細(xì)胞抗體仍異常，因在其他醫(yī)院停藥及減量導(dǎo)致病情復(fù)發(fā)，當(dāng)重

新使用環(huán)孢素后患者血常規(guī)又恢復(fù)，故作者根據(jù)此2項(xiàng)結(jié)果來決定用藥時(shí)間和調(diào)整藥物劑量[12]。當(dāng)AA患者血象和骨髓象即使恢復(fù)正常后，若淋巴細(xì)胞亞群及血細(xì)胞抗體仍為陽性時(shí)，建議適當(dāng)延長(zhǎng)用藥時(shí)間。

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Clinical significance of detecting lymphocyte subsets and hematocyte antibody in aplastic anemia

GaoZeli，WangHongyun，YeMei，LiLi，ZhouLi,GuoFeng

(DepartmentofHematology,theAffiliatedHospitalofPanzhihuaUniversity,Panzhihua，Sichuan617000，China)

ObjectiveTo investigate of the change of peripheral blood lymphocyte subsets and blood cell antibodies in aplastic anemia and its clinical significance.MethodsThe lymphocyte subsets CD3+，CD3+CD4+，CD3+CD8+，CD4+/CD8+，CD3-CD19+，CD3-CD16+CD56+from 25 aplastic anemia(including SAA 7 cases，NSAA18 cases)，and hematocyte antibody detection(granulocyte,erythrocyte,platelet cytomembrane) and 20 controls were examined by flow cytometry.ResultsCD4+T lymphocyte percentage,CD4/CD8 ratio,the percentage of CD56+in aplastic anemia patients significantly decreased(P<0.05).Blood cell antibodies (platelet antibody,erythrocyte antibody,granulocyte antibody) were significantly higher than the control group (P<0.05).ConclusionAplastic anemia cellular immune function in patients is abnormal,and antibody positive rate is high,and it prompt that humoral immunity is also abnormal.

anemia aplastic;lymphocyte subsets;hematocyte antibody

高澤莉(1971-)，副主任醫(yī)師，本科，主要從事臨床再生障礙性貧血研究。

論著·臨床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.07.012

R556.5

A

1671-8348(2016)07-0903-02

2015-09-14

2015-11-19)