3例杜氏肌營養不良家系基因診斷策略探討*

陳遠春，代　英，鐘　敏

(1.重慶醫科大學附屬兒童醫院神經內科　400014; 2.重慶涪陵中心醫院兒科　408000；3.重慶醫科大學附屬兒童醫院兒童保健科　400014; 4.兒科學重慶市重點實驗室/兒童發育疾病研究教育部重點實驗室　400014)

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·技術與方法·

3例杜氏肌營養不良家系基因診斷策略探討*

陳遠春1,2，代英3,4，鐘敏1.4△

(1.重慶醫科大學附屬兒童醫院神經內科400014; 2.重慶涪陵中心醫院兒科408000；3.重慶醫科大學附屬兒童醫院兒童保健科400014; 4.兒科學重慶市重點實驗室/兒童發育疾病研究教育部重點實驗室400014)

目的對3例既往多重PCR基因檢測陰性的杜氏肌營養不良(DMD)家系進一步進行基因診斷及家系成員遺傳指導。方法收集先證者及其家系成員的臨床資料和基因組DNA，多重連接依賴的探針擴增(MLPA)或第2代高通量測序對DNA樣本進行DMD基因突變檢測。結果家系1檢測到3名男性Exon 7缺失，2名女性雜合子攜帶者。家系2先證者chrX-32486626的Exon 23發現c.3127C>T，其母chrX-32486626存在c.3127C>T雜合突變，患兒母親目前孕中胎兒系女孩。家系3先證者chrX-32509581的Exon 20發現c.2411G>A，其母chrX-32509581存在c.2411G>A的雜合突變。結論MLPA或聯合第2代高通量測序能夠有效基因確診DMD患者及其家系成員，為遺傳咨詢及產前診斷提供依據。

肌營養不良，杜氏；基因；突變；高通量測序

杜氏肌營養不良(duchenne muscular dystrophy，DMD) 是由位于Xp21.2的DMD基因缺陷所致的X連鎖隱性遺傳病，活產男嬰發病率約1/(3 600～6 000)[1]。該編碼基因包含79個外顯子、78個內含子和8個啟動子，已報道的基因突變多達7 000余種，突變類型多樣：大片段缺失突變約60%，大片段重復占7%，微小缺失或插入占7%，單堿基點突變占20%，剪切位點突變占2%，還包括少量復雜突變和內含子突變[2-5]。本研究中3例DMD家系既往多重PCR基因檢測均陰性，通過多重連接探針擴增技術(MLPA)和第2代高通量測序最終找到致病的基因突變位點而確診，為家系成員遺傳咨詢及產前診斷提供了準確依據。

1　資料與方法

1.1一般資料家系1,先證者1，男，6歲半，G7P5，否認產傷窒息史，1歲3個月會走路。自4歲開始漸漸出現肢體乏力，行走緩慢，鴨步，易跌跤，漸加重至蹲起困難，雙小腿增粗變硬。查體：營養中等，鴨步，Gower征(+)，雙側腓腸肌中度肥大，觸之稍硬，雙下肢肌力Ⅳ級。肌電圖示肌源性損害；血肌酸激酶4 050 U/L(參考值50～220 U/L)。重慶醫科大學附屬兒童醫院多重PCR檢測DMD基因熱點區域基因缺失未見異常。家系調查：患兒父母體健，非近親結婚，患兒大哥幼年有類似病史，現在19+歲，已經癱臥于床，全身肌肉萎縮。Ⅲ4(第3代第4名家系成員)現年3+歲，腓腸肌輕度肥大，肌力、肌張力尚正常。家系2,先證者2，男，7歲，2013年重慶醫科大學附屬兒童醫院臨床診斷為DMD，因患兒母親再次懷孕6個月，為評估此次懷孕胎兒患病風險而來院復診。G1P1，無產傷窒息史。1歲半走路。近4歲開始漸漸出現行走乏力，漸至蹲起困難，鴨步。查體：營養尚可，心音有力，無心界擴大，鴨步步態，Gower征(+)，雙側腓腸肌中度肥大，觸之稍硬，雙下肢肌力Ⅳ級。肌電圖示肌源性損害；血肌酸激酶12 400 U/L；2013年重慶醫科大學附屬兒童醫院多重PCR基因檢測未見異常。家族史無異。家系3,先證者3，男，5歲，2015年初重慶醫科大學附屬兒童醫院臨床診斷DMD，為進一步了解再次生育后代患病風險而來院就診。患兒系G1P1，無產傷窒息史。1歲2個月走路。4歲半漸出現行走易累，上臺階乏力。查體：營養尚可，未見鴨步步態，Gower征(±)，雙側腓腸肌輕度肥大，單足跳稍差。肌電圖示肌源性損害；血肌酸激酶5 100 U/L；2015年初重慶醫科大學附屬兒童醫院多重PCR基因檢測未見異常。家族史無異。

1.2方法

1.2.1基因組DNA的提取患兒監護人簽署知情同意書，所有研究經重慶醫科大學附屬兒童醫院臨床醫學倫理研究委員會同意。取患兒及其父母親外周血各2 mL，家系1加取其他4位同胞兄弟姐妹、外祖父母及祖父母外周血各2 mL，乙二胺四乙酸鈉抗凝。用基因組DNA提取試劑盒(QIAamp DNA Blood Midi Kit，Qiagen，Hilden，Germany)提取DNA。

1.2.2MLPA購買荷蘭MRC-Holland公司檢測試劑盒SALSAP034和P035。根據說明書操作，基因組DNA變性后與SALSA MLPA探針雜交，雜交時間16 h，加入連接緩沖液和連接酶進行連接反應，經PCR擴增后用ABI 3130基因分析儀進行毛細管電泳，所得數據用Gene Marker v1.6軟件分析，通過計算健康對照人群平均擴增峰值，對所擴增峰值進行標準化處理，分析得出MLPA分析結果圖。每次MLPA檢測都包括一個健康對照樣本，檢測結果重復2次。發現致病的基因突變即確診，未發現異常的繼續進行第2代高通量的測序。

1.2.3第2代高通量測序利用Covaris S220超聲波儀(massachusetts，USA)將先證者2和3基因組DNA打斷成200～250 bp的片段。將1 μg提純的DNA片段進行末端修復并連接上標記性接頭，完成單個患者的DNA建庫。用定制的基因片段捕獲芯片SureSelect DNA Target Enrichment Baits (Agilent Technologies，Santa Clara，USA)，與2～4個標記好的患者DNA庫雜交16 h，除去未結合的片段。洗脫芯片特異性篩選的片段，再進行雜交后擴增，最后進行高通量測序儀Illumina HiSeq2000 Analyzers (Illumina，San Diego，USA)連續測序200個循環，并用Illumina bcl2fastq Conversion (Version 1.8.4)讀出原始測序數據。用此前經過驗證的過濾原則對原始數據進行篩選，生成雙端100 bp的過濾后數據。再將這些數據利用軟件(Burrows Wheeler Aligner Multi．Visionsoftware package)與參考序列[the reference human genome from the NCBI database(Build 37)]進行比對，輸出測序結果。最后利用SOAPsnp軟件和Samtools pileup軟件找出點突變、微小缺失和插入。

1.2.4Sanger法驗證對于先證者2和3發現的致病突變，在其所在片段上下游設計引物，PCR擴增并對產物做Sanger測序，所得結果與DMD基因標準序列(NG_012232．1)進行比對，從而驗證基因芯片捕獲和高通量測序的結果。兩位先證者的父母也進行該法驗證。

2　結　　果

家系1的家系圖如圖1所示，先證者1的MLPA檢測發現DMD基因Exon 7缺失。Ⅲ1和Ⅲ4均發現DMD基因Exon 7缺失，結合臨床均確診為DMD。Ⅰ4和Ⅱ2均系該Exon 7基因缺失雜合子攜帶者。

圖1　　先證者1家系圖

家系2和3 MLPA檢測未見致病的基因突變，故進行第2代高通量測序。先證者2的檢測結果顯示：chrX-32486626位置Exon 23區域發現一處半合子突變：c.3127C>T。家系驗證結果：其母chrX-32486626存在c.3127C>T的雜合突變，其父未見異常，見圖2～3。患兒母親到產科進行醫學必要胎兒性別鑒定系女孩。先證者3結果：chrX-32509581位置Exon 20區域發現一處半合子突變：c.2411G>A。家系驗證結果：其母chrX-32509581存在c.2411G>A的雜合突變，其父未見異常。查詢HGMDpro數據庫發現先證者2和3的突變系致病突變。

突變位置用黑色虛線框出。

圖2患兒DMD基因chrX-32486626區域Exon 23:c.3127C>T

突變位置用紅色實線及箭頭標出。

圖3患兒母chrX-32486626存在c.3127C>T的雜合

突變

3　討　　論

DMD是兒科常見的遺傳性神經肌肉病，發病男性占絕大多數，女性常為攜帶者，約2/3 患兒的病變基因來自于母親，近1/3 病例系新發突變[6]。一般3～5歲發病，全身乏力呈進行性加重，逐漸臥床，最終因心功能不全和(或)呼吸衰竭多于20歲左右死亡，嚴重影響兒童的身心健康[1-2]。近年來，隨著口服激素等治療方案的發展，患者的生存期和生活質量較以往有了一定改善。但是，本病迄今為止仍缺乏有效的根治方法。因此，高效、準確的基因診斷、攜帶者檢測及遺傳咨詢對有效減少新發病例至關重要[1-2,5]。

多重PCR是DMD的主要基因檢測手段，可診斷約30%～40%患者數的DMD基因外顯子熱點區域大片段缺失，但對于非熱區的外顯子缺失、非缺失突變和女性攜帶者不能檢測[7-12]。本研究的3個家系多重PCR檢測未發現致病的基因突變位點，故進行進一步的基因分析。MLPA能有效檢測大片段缺失或重復突變，使基因確診率提高到70%左右[7-14]。家系1通過該技術確診包括先證者在內的3名男孩均系DMD患者，同胞的2名姐妹均未攜帶致病基因，患兒母親及外婆系突變基因攜帶者，為患兒家系成員的診斷及遺傳咨詢提供了有力證據。但是，家系2和3仍未檢測到致病的基因突變位點。據報道，通過多重PCR結合MLPA檢測，仍有占全部DMD致病突變30%左右的微小突變不能檢測到，近年來第2代高通量測序使得這部分微小突變檢測成為可能[7-12]。故家系2和3繼續進行該2代測序，均發現先證者和攜帶者的致病基因突變位點。家系2的母親此次懷孕系女嬰，故可正常分娩。遺傳指導家系成員的生育風險，最大程度杜絕后代中本病的發生。家系3的先證者母親被證實系突變致病基因攜帶者，為后期的再次懷孕給產科提供了準確的依據。本研究的3個家系診斷過程值得臨床醫生高度關注。

因此，掌握本病正確的基因診斷策略對每個醫務工作者都至關重要。從經濟角度考慮，對臨床表現和普通血生化檢測疑診DMD患者，先行多重PCR分析，陰性者再予MLPA，仍陰性但高度疑診患者，考慮第2代高通量測序。在檢測成本進一步降低后，有望通過該單一檢測就能涵蓋幾乎全部的DMD突變類型及其他上百種肌病的基因突變，縮短了診斷周期，為遺傳咨詢以及進行產前診斷提供依據，使患者及其家系成員最大程度獲益。這在目前DMD尚缺乏有效根治手段的情況下意義尤其重大。

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Gene diagnosis in 3 family members of Duchenne muscular dystrophy

ChenYuanchun1,2,DaiYing3,4,ZhongMin1,4△

(1.DepartmentofNeurology,Children′sHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400014,China;2.DepartmentofPediatrics,theCentralHospitalofFulin,Chongqing408000,China;3.DepartmentofChildHealth,Children′sHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400014,China;4.ChongqingKeyLaboratoryofPediatrics/MinistryofEducationKeyLaboratoryofChildDevelopmentandDisorders,Chongqing400014,China)

ObjectiveTo perform gene diagnosis of Duchenne muscular dystrophy(DMD) in 3 family members who were negative for DMD gene detected by multiplex PCR and to provide genetic counseling for their family members accordingly.MethodsThe clinical data and genomic DNA of patients and their family members were collected,DMD gene mutation were detected by multiplex ligation dependent probe amplification (MLPA) or the 2nd generation of high-throughput sequencing.ResultsIn the first family,3 male patients were detected deletion of Exon 7 and 2 female were heterozygous carriers.In the second family,it was found in the proband that point mutation of c.3127C>T in the Exon 23 of chrX-32486626 and c.3127C>T heterozygous mutations was confirmed in his mother,the mother was pregnant with a girl.In the third family,point mutation of c.2411G>A was detected in the Exon 20 of chrX-32509581 in the proband and his mother had c.2411G>A heterozygous mutation.ConclusionMLPA or combining with the 2nd generation of high-throughput sequencing can offer effective gene diagnosis for the patients of DMD and their family members,and provide the basis for genetic counseling and prenatal diagnosis.

muscular dystrophy，Duchenne;gene;mutation；high throughput sequencing

陳遠春(1978-)，主治醫師，碩士，主要從事兒科臨床診治工作。△

，E-mail:cy_zm11@126.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.07.020

R746.2

A

1671-8348(2016)07-0926-03

2015-09-08

2015-11-20)