miR30a體外干預乳腺癌腋窩腫大淋巴結中腫瘤干細胞相關基因表達和侵襲力的變化*

周　健,余天霧△,呂永雙,蔣小衛

(1.重慶醫科大學附屬永川醫院普通外科3病區　402160;2.重慶醫科大學附屬第二臨床學院三腺外科　400010)

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論著·基礎研究

miR30a體外干預乳腺癌腋窩腫大淋巴結中腫瘤干細胞相關基因表達和侵襲力的變化*

周健1,余天霧1△,呂永雙1,蔣小衛2

(1.重慶醫科大學附屬永川醫院普通外科3病區402160;2.重慶醫科大學附屬第二臨床學院三腺外科400010)

目的探討腫瘤干細胞在乳腺癌患者腋窩腫大淋巴結中微轉移灶及微小RNA30a(miR30a)對其侵襲能力的影響，初步探討miRNAs抗乳腺癌治療的可行性。方法從乳腺癌患者腋窩腫大淋巴結中分離、培養腫瘤干細胞樣乳腺癌細胞。合成 miR30a 寡核苷酸片段，應用腺病毒將該片段轉染人原代乳腺癌細胞，同時設乳腺癌MDA-MB-231細胞株為試驗對照，每組細胞均設空載體組、空白對照組，以熒光顯微鏡評估轉染效率。以 Transwell 小室體外侵襲試驗檢測轉染前后腫瘤細胞增殖和侵襲力的變化。以Western blot分別檢測ALDH1、Vimentin和N-Cadherin蛋白表達。結果Transwell小室體外侵襲試驗顯示空白對照組中原代乳腺癌細胞較 MDA-MB-231 細胞株侵襲力強，其侵襲指數分別為(75.3±3.2)%，(58.4±2.8)%，兩者差異有統計學意義(P<0.05)，而轉染miR30a后這兩種細胞體外侵襲力均明顯減弱，其侵襲指數分別為(21.4±1.9)%,(28.2±2.3)%，與各自空白對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)。結論乳腺癌患者部分腋窩增生腫大的淋巴結中ALDH表達增高，可能存在腫瘤微轉移，術中應完全清掃為宜。miR30a抑制了腫瘤干性基因表達和侵襲能力。

乳腺腫瘤；干細胞；腋窩腫大淋巴結；腫瘤轉移；侵襲；miR30a

乳腺癌干細胞(breast cancer stem cells)可能是乳腺癌術后局部復發和轉移的關鍵因素[1]。對其鑒別主要是基于腫瘤細胞表面的分子表型如CD44+/CD24-/low或乙醛脫氫酶1陽性(aldehyde dehydrogenase 1,ALDH1)[2]。

乳腺癌細胞出現上皮細胞向間質細胞轉變(epithelial to mesenchymal transition,EMT) 是上皮細胞獲得侵襲、遷移能力的主要方式。因此，研究乳腺癌腋窩淋巴結微轉移灶及尋找針對乳腺癌干細胞的有效措施具有重要意義。小RNA干擾可通過各種生物學行為在轉錄后水平負性調控靶基因的表達，影響多種靶基因的生物學行為，如細胞的生長、凋亡、增殖、分化、轉化和衰老[3]。Ouzounova等[4]報道 miR30a 在體內過表達影響乳腺癌的進展，其家族在非黏附的環境中調節乳腺癌細胞的生長。因此，本課題通過檢測浸潤性乳腺癌患者腋窩增生、腫大淋巴結中乳腺癌干細胞微轉移灶，為臨床常規清掃腋窩淋巴結微轉移灶提供初步依據并探索微小RNA30a(miR30a)干擾對微轉移灶中EMT型細胞干性基因的表達和侵襲力的影響，為乳腺癌轉移灶的治療提供一種新的靶點。

1　材料與方法

1.1試劑及材料人白血病抑制因子(hLIF)、人前列腺素源生長因子(h-PDGF)、人表皮細胞生長因子(hEGF)、人堿性成纖維細胞生長因子(b-FGF) 和人 B-27 培養基購自美國Protech公司；DMEM/F12、胎牛血清購自德國 Hyclone公司；結晶紫粉購自南京生物試劑公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑、透明質酸酶和Ⅲ型膠原酶購自英國Sigma公司；腺病毒miR30a載體購自上海吉瑪制藥技術有限公司；MDA-MB-231細胞株獲自重慶醫科大學附屬第二醫院中心實驗室提供；基質膠(matrix matrigel)、兔抗人CD44-FITC、ALDH1-PE、CD24-PE和鼠抗兔IgG同型對照抗體(FITC)購自美國Santa Cruz公司；兔抗人Vimentin、N-Cadherin、ALDH1多克隆抗體購自美國Ebioscience公司；Transwell小室(孔徑8 μm)購自美國Milipore公司；PCR試劑盒購自日本Takara公司成都分公司。

1.2無血清法原代乳腺癌干細胞分離、培養部分參照文獻[5]進行。將約1 g大小的腫瘤組織或淋巴結剪碎(約1 mm3)浸入DMEM/F12無血清培養基中，于37 ℃,5% CO2培養箱中消化組織塊。過濾，離心5 min(500～1 000 r/min)，收集脫落細胞，共消化4～5 h。收集洗滌后的細胞于DMEM/F12完全培養基培養，24 h后棄去懸浮細胞。待長滿皿底時，換以DMEM/F12無血清培養基培養，每1～2天倒置顯微鏡下觀察1次生長狀態和融合、成球的情況。待12 d時收集懸浮細胞將其標記為腫瘤干細胞原代(P0)。其鋪滿皿底將細胞消化傳代。同法以無血清培養基培養人乳腺癌細胞株MDA-MB-231。

1.3流式細胞儀鑒定腫瘤細胞表型消化、收集培養的腫瘤細胞(P0)，制作單細胞懸液，按流式抗體說明書以2%的體積分數加入CD44-FITC和CD24-PE抗體(工作液1∶20稀釋)并準備同型對照抗體細胞。以流式細胞儀檢測CD44、CD24和ALDH1陽性細胞的含量，重復檢測2次，取其平均值。

1.4miR30a腺病毒轉染乳腺癌細胞將提取的腫大腋窩淋巴結中腫瘤細胞分為3組：試驗組1(腺病毒miR30a)、空載體組1和空白對照組1，同時以乳腺癌細胞株MDA-MB-231為對照，轉染相應腺病毒后設立試驗組2、空白載體組2和空白組2。靶細胞鋪板：試驗前1 d，向24孔板孔內加入完全培養基(500 μL/孔，靶細胞：5×104個)，于37 ℃，5% CO2培養箱中繼續培養過夜。第2天將病毒原液混勻后加入培養板(400 μL/孔)，同時加入polybrene，24 h后棄掉病毒液，換為新鮮完全培養基，7 d后觀察并拍照。計算轉染率：試驗組和空載體組，每組3復孔，每組計數6～8個視野(40倍高倍鏡)，取平均值計入公式：轉染率(%)=熒光細胞數/細胞總數×100%。

1.5Transwell小室侵襲試驗及細胞增殖力檢測將Transwell上室內均勻涂一層稀釋的基質膠，每組各設3個復孔。向各組Transwell下室加入DMEM完全培養基，向上室內加入細胞懸液，于37 ℃，5% CO2培養12～24 h。以棉簽檫去上室基質膠上的細胞后75%乙醇固定，以結晶紫液(2 g/100 mL)染色 15 min后流水沖洗。吹干后倒置顯微鏡下計數穿膜細胞數并拍照。結果計算：設穿過無Matrigel膠的微孔濾膜細胞數為對照，各試驗組穿過Matrigel膠的細胞數與其相比得到相對百分率，以此百分率表示癌細胞體外侵襲指數。MTT法檢測腫瘤細胞的增殖指數向24孔板Transwell小室的下室完全培養基中加入MTT溶液(5 mg/mL)150 μL/孔，將小室膜浸沒在培養液中，37 ℃培養4 h；離心去上清液后加入二甲基亞砜(DMSO)500 μL/孔，振蕩10 min，使結晶物充分溶解后將24孔板置于酶標儀上,設490 nm波長，測吸光度(A)值。

1.6RT-PCR檢測轉染細胞中miR30a的表達轉染篩選后細胞總RNA的提取按Trizol操作說明書并結合文獻進行操作。將轉染后的細胞加Trizol后，室溫放置5 min后離心，棄沉淀，加入氯仿后振蕩混勻后室溫放置15 min，4 ℃，12 000 r/min離心15 min后取上層水相，加入異丙醇室溫放置5 min后，離心10 min，棄上清液，加入75%乙醇溫和振蕩后離心5 min，棄上清液，真空干燥5 min后加入0.5%十二烷基硫酸鈉(SDS)溶解RNA樣品，測A值。

1.7Western blot 法檢測腫瘤細胞侵襲分子ALDH1、Vimentin、N-Cadherin的表達細胞為本試驗提取培養的人乳腺癌細胞。蛋白提取及蛋白凝膠電泳按照Western blot 說明書操作。培養細胞在80%濃度左右時，以胰酶酶解后裂解，離心收集在試管中，加入450 μL裂解液反復吹打，所得樣品用超聲細胞破碎儀處理，處理后的樣品入水浴箱加熱，離心后取上清液。

2　結　　果

2.1乳腺癌干細胞球的生長情況消化、分離乳腺癌患者腋窩腫大淋巴結標本，10例中分離出6例。試驗中1例污染，余5例于培養期間均出現部分細胞逐漸凋亡、崩解，部分細胞呈貼壁、增殖和分化狀態。3 d時鏡下見到細胞呈梭形、尖角狀或多角形，逐漸鋪滿瓶底。換用無血清培養基后僅小部分細胞體積逐漸變大及融合，約12 d后呈較大的單個或多個球狀懸浮細胞，折光性強，中心融合且部分發生凋亡。以完全培養基貼壁培養48 h后出現了細胞團，增殖、分裂成新生細胞，形態呈梭形或尖角狀，自第2、3代后細胞形態更規則。

2.2流式細胞儀細胞表型鑒定結果經流式細胞儀檢測，待測標本中活性細胞占總細胞量的89.50%，其中，ALDH1陽性細胞約占63.95%，CD24-/low約占總細胞數的1.13%，CD44+細胞約占89.78%。流式結果顯示在腋窩淋巴結中提取的癌細胞表面的干性基因分子ALDH1和CD44+有較高表達，而CD24-/low呈低表達，這表明經無血清培養法富集的腫瘤細胞具有干性特征。

2.3轉染miR30a后細胞增殖能力檢測通過MTT法檢測轉染 miR30a 48 h后從腋窩淋巴結提取的細胞和乳腺癌細胞株MDA-MB-231的增殖指數，發現兩種細胞與各自空白對照組及空載體組比較，其增殖、生長能力明顯受到了抑制，盡管未出現大面積的細胞死亡、崩解，但生長均極其緩慢，于轉染后7～10 d才鋪滿皿底，且細胞間不會完全接觸。經MTT法檢測，發現試驗組1、2細胞增殖能力較各自對應的空載體組1、2和空白對照組1、2明顯降低 (P<0.05)，見圖1。

A：試驗組1；B：試驗組2；C：空載體組1；D：空載體組2；E：空白對照組1；F：空白對照組2。a:P<0.05；b:P>0.05。

圖1MTT法檢測各組細胞增殖能力

2.4檢測結果試驗結果證實腋窩腫大淋巴結內提取培養的腫瘤細胞具有明顯的侵襲和遷徙能力，見圖2。空白載體組1、2的侵襲指數分別為(88.6±2.6)%、(63.1±2.0)%，兩者比較差異有統計學意義(P<0.05)；而試驗組1、2的侵襲指數分別為(21.4±1.9)%、(28.2±2.3)%，兩者間差異無統計學意義(P>0.05)，但是分別與空白對照組1(75.3±3.2)%，空白對照組2(58.4±2.8)%相比差異有統計學意義(P<0.05)；而空白對照組1、2和空載體組1、2之間相比差異無統計學意義(P>0.05)。

A：試驗組1；B：試驗組2；C：空載體組1；D：空載體組2；E：空白對照組1；F：空白對照組2。

圖2Transwell 檢測腫瘤細胞的侵襲遷徙能力(結晶紫染色×200)

1：空白對照組1；2：空載體組1；3：試驗組1；4：空白對照組2；5：空載體組2；6：試驗組2。a:P<0.05；b:P>0.05。

圖3Western blot檢測ALDH1在人原代乳腺癌細胞中的表達

2.5轉染 miR30a后腫瘤ALDH1、Vimentin、N-Cadherin的表達變化空白對照組1 ALDH1表達較空白對照組2，差異無統計學意義(P>0.05)，試驗組1 ALDH1表達較空載體組1及空白對照組1顯著下降(P<0.05)；試驗組2 ALDH1表達較空載體組2及空白對照組2顯著下降(P<0.05)；且試驗組1與試驗組2差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。Vimentin(圖4)和N-Cadherin(圖5)在空白對照組1、2及空載體組1、2的兩種細胞中表達量均很高，而空白對照組1較空白對照組2及空載體組1較空載體組2表達更高(P<0.05)。試驗組中兩種細胞Vimentin和N-Cadherin的蛋白表達量均明顯下降，相較而言，試驗組1和試驗組2較對應的空白對照組及空載體組均要弱很多(P<0.05)。但是試驗組中間的表達強弱無明顯的差別(P>0.05)。

1：空白對照組1；2：空載體組1；3：試驗組1；4：空白對照組2；5：空載體組2；6：試驗組2。a:P<0.05；b:P>0.05。

圖4Western blot 檢測Vimentin在人原代乳腺癌細胞中的表達

1：空白對照組1；2：空載體組1；3：試驗組1；4：空白對照組2；5：空載體組2；6：試驗組2。a:P<0.05；b:P>0.05。

圖5Western blot 檢測N-Cadherin在人乳腺癌細胞中的表達

3　討　　論

有報道稱，表達CD44+表面分子、不表達或低表達CD24-分子的乳腺癌細胞具有腫瘤干細胞的特性[6]。而近年來ALDH1是更具鑒定意義的乳腺癌干細胞的標志物[7]；這類細胞能形成乳球細胞、自我更新、侵襲力增強、成瘤和遠處轉移的潛能[8]。Ginestier等[9]報道ALDH1的腫瘤細胞也可能是乳腺癌遠處轉移的重要介導子，這類細胞已被認為比CD44+/CD24-更易形成腫瘤，是比CD44+/CD24-更好的預測標志分子。本研究從乳腺癌患者腋窩增生、腫大的淋巴結中提取的細胞經流式細胞儀檢測證實其部分細胞的干性標志物CD44+和ALDH1都有較高水平的表達，CD24-呈低表達或不表達，其增殖指數較空白對照組2細胞強，EMT的侵襲分子(Vimentin 和 N-Cadherin)表達上調，表明這類細胞在腫瘤轉移中具有重要作用。Tanei等[10]發現ALDH1陽性乳腺癌患者在治療上完全緩解率顯著低于ALDH1陰性的患者。因此，ALDH1是否高表達與乳腺癌的關系極其密切，且與乳腺癌患者疾病的惡性程度和預后相關。

文獻報道微小RNAs通過調控干細胞關鍵調節基因的表達完成干細胞的自我更新和分化[11]，如 miR-203 可以調節EMT標志物分子的表達，如 E-cadherin，CSCs的標志物 CD44+[12]；miR-127的過表達或BCL6的耗竭抑制了乳腺癌細胞的增殖[13]。本研究結果顯示miR30a 抑制了乳腺癌原發灶、轉移淋巴結和增生腫大的淋巴結中腫瘤干性標志物ALDH1、CD44的表達來抑制腫瘤的進展。對腫瘤侵襲分子EMT的標志分子Vimentin 和N-Cadherin 也顯示出了抑制作用。然而miR30a在可疑的乳腺癌腋窩淋巴結轉移中異常表達的精確分子機制還有待研究。

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Intervention in vitro of miR30a on tumor stem cell related gene expression and invasiveness of breast cancer swollen axillary lymph nodes*

ZhouJian1，YuTianwu1△，LvYongshuang1，JiangXiaowei2

(1.ThirdDepartmentofGeneralSurgery,AffiliatedYongchuanHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing402160,China；2.DepartmentofThreeGlandsSurgery,SecondClinicalCollegeofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China)

ObjectiveTo investigate the micrometastatic lesion of tumor stem cells in the axillary swollen lymph nodes of breast cancer patients and the influence of miR30a on its invasive ability,and to explore the feasibility of miRNAs anti-breast cancer treatment.MethodsThe tumor stem cell-like breast cancer cells were separated from the axillary swollen lymph nodes in breast cancer patients and cultured.miR30a oligonucleotide fragment was synthesized and transfected into human primary generation breast cancer cells by using adenovirus,meanwhile the breast cancer cell line MDA-MB-231 was taken as the experimental control and the transfection efficiency was assessed by the fluorescence microscopy.The changes of tumor cell proliferation and invasiveness before and after transfection were detected by the Transwell chamber in vitro invasion assay.Western blot was used to detect the ALDH1,Vimentin and N-Cadherin protein expression.ResultsThe Transwell chamber in vitro invasion assay showed that the primary generation breast cancer cell had more strong invasive ability than MDA-MB-231 cell line,their invasion indexes were (75.3±3.2)% and (58.4±2.8)% respectively,the difference was statistically significant (P<0.05),and after transfecting miR30a,the in vitro invasiveness ability in these two kinds of cells were significantly weakened and their invasion indexes were (21.4±1.9)% and (28.2±2.3)% respectively,the difference compared with the control group showed the statistical significance (P<0.05).ConclusionThe ALDH expression in partial axillary hyperplasia and swollen lymph nodes in the patients with breast cancer is increased,and the tumor micrometastasis may exist,which should be completely cleaned in operation.miR30a inhibits the expression and invasive ability of tumor stem gene.

breast neoplasms;stem cell;axillary lymph nodes;neoplasms metastasis;invasiveness;miR30a

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.12.007

重慶市科技計劃項目科研基金支持(CSTC2011JJA10038)。作者簡介：周健(1986-)，主治醫師，碩士，主要從事乳腺腫瘤治療研究。△

，E-mail:674079699@qq.com。

R73.37

A

1671-8348(2016)12-1605-03

2015-11-18

2015-12-24)