淫羊藿苷通過增強Fas-FasL表達活性誘導裸鼠食管癌細胞凋亡*

紀　昕，王　崇，李　潔，岳曉樂，張艷華，李永軍△

(1.河北醫科大學第二醫院檢驗科,石家莊 050000；2.河北醫科大學第四醫院科研中心,石家莊 050011；3.河北省辛集市第一醫院檢驗科　052300)

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論著·基礎研究

淫羊藿苷通過增強Fas-FasL表達活性誘導裸鼠食管癌細胞凋亡*

紀昕1，王崇1，李潔2，岳曉樂1，張艷華3，李永軍1△

(1.河北醫科大學第二醫院檢驗科,石家莊 050000；2.河北醫科大學第四醫院科研中心,石家莊 050011；3.河北省辛集市第一醫院檢驗科052300)

目的探討淫羊藿苷(icariin，ICA)對裸鼠體內食管癌移植瘤生長的抑制作用，并初步探討其機制。方法應用MTT方法和Giemsa染色法檢測和觀察ICA對食管癌細胞Eca-109和TE-13的體外抑制作用。構建裸鼠的食管癌細胞移植性腫瘤模型，分為3組，每組6只。實驗組每只裸鼠腹腔注射50 mg/kg ICA，對照組注射相同體積的生理鹽水，陽性對照組腹腔注射2 mg/kg順鉑，每2天1次，共14 d，每3天測量腫瘤體積，實驗結束后稱量腫瘤質量；TUNEL染色法觀察各組裸鼠腫瘤組織的組織形態變化和凋亡情況；免疫組織化學法對腫瘤組織中Fas和FasL蛋白的表達變化進行分析。ELISA法檢測外周血中FasL和IFN-γ的水平。結果ICA體外對食管癌細胞Eca-109和TE-13的增殖無明顯的抑制作用。實驗組和陽性對照組裸鼠腫瘤平均體積和質量與對照組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。TUNEL染色法結果顯示，實驗組裸鼠的腫瘤組織發生了明顯的凋亡，凋亡細胞的數量較對照組明顯增加(P<0.05)。免疫組織化學實驗結果表明，與對照組相比，實驗組裸鼠腫瘤組織中Fas、FasL的表達明顯增加(P<0.05)。ELISA實驗結果顯示，實驗組裸鼠外周血中FasL和IFN-γ的水平較對照組明顯增高(P<0.05)。結論ICA體外對食管癌細胞無明顯增殖抑制作用，但是通過Fas的表達、FasL和IFN-γ的分泌在體內誘導食管癌細胞凋亡，從而發揮抗食管癌的作用。

淫羊藿苷；食管腫瘤；Fas-FasL；細胞凋亡

食管癌是危害我國民眾健康最為嚴重的惡性腫瘤之一，依據2014年世界衛生組織最新統計結果，食管癌發病率在我國惡性腫瘤中居第5位，病死率居第4 位。2014年中國死于食管癌的人數約為197 400例，超過全世界食管癌總死亡人數的一半[1]。放射治療與化學治療對某些患者確實有效，也挽救了部分患者的生命，但有明顯的毒副作用，長期服用易造成患者免疫系統、消化系統和其他重要器官的嚴重損害，導致患者承受巨大的痛苦，生存質量下降[2]。因此，尋找能夠協同或者代替放射治療與化學治療，確保治療效果，同時減低毒副作用的藥物是科研工作者長期而艱巨的任務。近年來，植物制劑及其衍生物的應用在癌癥治療中發揮巨大作用[3-9]。淫羊藿為補益類中藥，具有溫腎壯陽，強筋骨，祛風濕的功能，體內外研究發現，淫羊藿的主體成分淫羊藿苷(icariin，ICA)具有良好的抗腫瘤和免疫調節活性[10-13]。本研究通過構建裸鼠食管癌移植瘤模型，并以生理鹽水和ICA分別處理裸鼠，監測腫瘤的成瘤情況和生長狀況，并在腫瘤組織中檢測相關蛋白的表達水平，探討ICA對食管癌細胞的增殖和凋亡的影響，以期探索將ICA作為抗食管癌藥物的可能性。

1　材料與方法

1.1實驗材料ICA購自美國Sigma公司，生產批號：MKBR8091V，純度大于96%，胎牛血清和RPMI1640培養基購自Gibco-BRL公司，MTT和TUNEL染色試劑盒購自美國Promega公司，Giemsa染色試劑盒購自Baso公司，二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司，IFN-γ和FasL的ELISA試劑盒購自伊萊瑞特(Elabscience)生物科技有限公司，兔抗鼠Fas、FasL一抗體購自Santa Cruz公司，SP免疫組織化學試劑盒購自北京中杉金橋公司。

1.2實驗動物及分組BALB/c型裸鼠，18只，5～6周齡，體質量(20.2±0.7)g，雄性，均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，在河北醫科大學第四醫院動物實驗中心飼養，實驗動物使用許可證號SYXK(冀)2013-0051。動物實驗研究經動物管理使用委員會和倫理委員會批準。實驗組裸鼠每只腹腔注射濃度10 mg/mL ICA 100 μL，給藥劑量為50 mg/kg，對照組注射相同體積的生理鹽水，陽性對照組腹腔注射順鉑(2 mg/kg)，每2天1次，共14 d，每3天測量腫瘤體積，實驗結束后稱量腫瘤質量。按公式計算腫瘤體積：腫瘤體積=(1/2×長×寬2)。25 d后處死裸鼠并稱量腫瘤質量。

1.3細胞培養食管癌細胞系TE-13、Eca-109細胞由上?？茖W院細胞生物研究所提供。所有細胞系培養于10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，含100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素，于37 ℃、5% CO2條件下培養。以0.25%的胰蛋白酶消化細胞并傳代，每1～2天換液1次，取對數生長期的細胞用于實驗。

1.4細胞活力檢測

1.4.1應用MTT方法檢測10、50、100 mg/mL ICA對食管癌細胞Eca-109和TE-13增殖能力的影響于96孔板中加入1×104細胞并培養48 h，每孔加10 mg/mL MTT 10 μL并于37 ℃ 孵育3 h，然后移除上清液，加入150 μL DMSO并于室溫輕輕搖晃15～20 min。用全自動定量酶標儀在波長492 nm處測定吸光度(A)，以上實驗結果重復3遍。ICA對食管癌細胞增殖的作用以細胞增長抑制率表示，用公式表示：抑制率=[(對照組A值-實驗組A值)/對照組A值]×100%。

1.4.2應用Giemsa染色法觀察100 mg/mL ICA對食管癌細胞Eca-109和TE-13的體外抑制作用分別制備對照組和實驗組腫瘤細胞涂片，干燥后于涂片上滴加A溶液0.5～0.8 mL，染液覆蓋整個涂片染色1 min，滴加B溶液于A溶液上，滴加量約為A溶液2倍，以洗耳球吹勻后染色5～10 min，蒸餾水沖洗、干燥后顯微鏡觀察細胞。

1.5裸鼠種植性腫瘤模型的建立、治療及標本處理于BALB/c型裸鼠右側肩胛下注射0.1 mL TE-13細胞(含2×106個細胞)，當腫瘤體積增長到約50 mm3，裸鼠被分為3組，每組6只。

1.6TUNEL染色法檢測細胞凋亡裸鼠移植瘤石蠟切片5 μm，二甲苯脫蠟，PBS沖洗，胰蛋白酶消化，PBS沖洗；加TUNEL反應液37 ℃ 孵育60 min，PBS沖洗；加過氧化物酶抗體37 ℃ 孵育30 min，PBS沖洗；滴加二氨基聯苯胺(DAB)，室溫孵育10～30 min，PBS沖洗；封片、烘干，光鏡下觀察細胞核中有棕黃色顆粒的細胞為陽性細胞。

1.7免疫組織化學檢測組織Fas、FasL蛋白表達水平將裸鼠移植瘤制成石蠟切片，按免疫組織化學試劑盒說明書所述方法檢測Fas、FasL蛋白的表達情況。FasL抗體按 1∶100 稀釋，生物素化山羊抗兔二抗和辣根過氧物酶標記的鏈霉卵白素(三抗)為試劑盒中的原液。DAB試劑顯色后，用蘇木素對比染色，中性樹膠封片，光鏡下觀察結果。

1.8ELISA方法檢測外周血FasL和IFN-γ表達水平通過摘眼球法取各組小鼠外周血液，凝集離心后取血清100 μL,用ELISA 試劑盒測定FasL和IFN-γ水平,操作步驟按產品說明書進行,在酶標測試儀上測定570 nm 處A值。根據標準曲線計算出外周血液中FasL、IFN-γ的水平。

2　結　　果

2.1ICA對食管癌細胞增殖的抑制作用不同濃度的ICA處理食管癌細胞TE-13和Eca-109 48 h后，用MTT實驗檢測細胞的活性，研究結果顯示無毒劑量的10、50、100 mg/mL ICA對食管癌細胞系TE-13、Eca-109細胞的增殖無明顯影響，見圖1；且細胞形態未發生明顯的改變。

圖1　　ICA對食管癌細胞增殖抑制作用

A：對照組；B：實驗組。

圖2TUNEL染色顯示荷瘤裸鼠移植瘤的凋亡情況(×200)

2.2ICA體內抑制腫瘤的形成ICA能明顯抑制食管癌細胞在體內的生長，見圖2。腫瘤細胞接種11 d后，對照組裸鼠的腫瘤體積開始增加，生長速度較快，而實驗組裸鼠腫瘤體積增長緩慢。實驗結束后，實驗組裸鼠的腫瘤平均體積和質量為(0.55±0.12)cm3、(0.32±0.09)mg，小于對照組的(0.91±0.35)cm3、(1.56±0.15)mg，差異有統計學意義(P<0.05)，陽性對照組的(0.42±0.13)cm3、(0.26±0.06)mg，與對照組相比差異也有統計學意義(P<0.05)，實驗組和陽性對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3ICA促進體內腫瘤細胞凋亡對兩組荷瘤裸鼠的腫瘤組織進行TUNEL染色。研究結果顯示，對照組裸鼠腫瘤組織內細胞核藍染，少見陽性凋亡細胞，實驗組小鼠腫瘤組織內可見陽性凋亡細胞，且細胞數量明顯高于對照組。見圖2。

2.4ICA體內調控腫瘤組織Fas和FasL蛋白的表達對兩組荷瘤裸鼠腫瘤組織進行免疫組織化學染色。Fas蛋白和FasL蛋白陽性染色定位于食管癌細胞的細胞質，呈棕黃色顆粒狀分布。與對照組相比，ICA能夠升高Fas蛋白的表達水平，同時升高FasL的表達水平。見圖3。

2.5ICA對裸鼠體內血清FasL和IFN-γ分泌的影響與對照組比較，實驗組小鼠外周血FasL和IFN-γ水平顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05),見圖4。

A：對照組Fas；B：實驗組Fas；C：對照組FasL；D:實驗組FasL。

圖3裸鼠移植瘤組織中Fas和FasL蛋白的表達水平(免疫組織化學×200)

a：P<0.05，與對照組比較。

圖4荷瘤裸鼠外周血中IFN-γ和 FasL的分泌水平

3　討　　論

淫羊藿來源于小檗科多年生植物淫羊藿屬的多種植物,為傳統的補虛壯陽中藥。近年研究表明,從淫羊藿中分離的黃酮類化合物ICA具有刺激機體免疫系統和刺激骨髓DNA合成的,增加外周血白細胞數量、骨髓造血干細胞中粒單系祖細胞數量等的功能，增強機體免疫功能。有文獻報道，100 mg/mL ICA能夠誘導肝癌HepG2.2.15細胞分化凋亡，抑制肝癌細胞和Hela細胞的生長[14]，中劑量ICA可以促進H22肝癌移植瘤小鼠細胞凋亡[15]。本實驗進一步研究了ICA在體內外對食管癌細胞的抑制作用，結果顯示用10、50、100 mg/mL濃度ICA體外處理食管癌細胞48 h后，對細胞的增殖無顯著影響，分析原因可能由于濃度較小未對食管癌細胞產生影響，但分別用生理鹽水和ICA處理小鼠25 d后，實驗組裸鼠腫瘤的平均體積和質量顯著降低；進行腫瘤組織的TUNEL染色，結果顯示ICA可明顯誘導腫瘤組織內的細胞發生凋亡，ICA (50 mg/kg)可明顯降低裸鼠體內的腫瘤負荷。

凋亡的發生與基因表達、蛋白質合成和細胞內Ca2+濃度的增高等多種生物行為有關，有不同的信號傳導系統介導和參與，其中Fas-FasL可直接啟動細胞凋亡的信號途徑，是介導細胞凋亡最為重要的跨膜蛋白分子[16-17]。正常情況下，腫瘤細胞表達Fas，T淋巴細胞在腫瘤抗原刺激和輔助性T淋巴細胞作用下活化、增殖，表達FasL，兩者結合后，帶有死亡結構域的Fas相關蛋白FADD可以激活Caspase基因，繼而激活下游半胱氨酸蛋白酶超家族系列成員，級聯反應促使Fas蛋白所在細胞發生凋亡就可能誘導腫瘤細胞凋亡。但是由于腫瘤細胞不表達、低表達或表達無功能的Fas[18]，亦或由于腫瘤細胞編碼的Caspase基因發生點突變，信號傳導機制產生缺陷，不能繼續向下傳遞凋亡信號，腫瘤細胞不發生凋亡就可能導致殺傷機制不能正常進行。IFN-γ是一種由激活免疫細胞分泌的細胞因子，具有直接抗腫瘤活性，或通過激活巨噬細胞產生細胞毒作用。Ⅰ型、Ⅱ型干擾素都具有調節和增強腫瘤細胞對Fas介導的細胞凋亡的敏感作用。干擾素通過調節Fas-FasL信號通路誘導細胞凋亡是近年來腫瘤免疫學研究熱點之一，IFN-γ可以通過干擾素受體上調腫瘤細胞的Fas水平和淋巴細胞的FasL水平或影響Fas介導腫瘤細胞凋亡敏感性加強該腫瘤免疫途徑，其可能機制是IFN-γ通過調控抗凋亡基因bcl-2家族、白細胞介素1β相關酶ICE基因、Caspase家族等相關基因而發揮作用。在本研究中，ICA可提升外周血中FasL和IFN-γ的分泌，并升高腫瘤組織內Fas和FasL的表達水平，這可能是ICA發揮抗腫瘤作用的重要機制之一。

迄今為止，惡性腫瘤的治療多為手術切除為主，放射治療、化學治療為輔的傳統方法，手術可以遏制腫瘤的繼續發展，但容易引起并發癥，如出血、術后感染、切口粘連等，且術后的復發率也較高。而放射治療和化學治療在殺死癌細胞的同時也不可避免地損傷正常細胞，毒副作用往往很大，而ICA是在中醫配方中廣泛出現的補益類中藥，將可能成為一種潛在的安全的抗癌藥物。但是ICA抗腫瘤機制還需要進一步研究和探討，解決此問題將有助于進一步研究ICA的功能和作用機制，為ICA用于腫瘤的治療提供理論基礎。

[1]Enzinger PC,Mayer RJ.Esophageal cancer[J].N Engl J Med,2003,349(23):2241-2252.

[2]Hou J,Liao LD,Xie YM,et al.DACT2 is a candidate tumor suppressor and prognostic marker in esophageal squamous cell carcinoma[J].Cancer Prev Res (Phila),2013,6(8):791-800.

[3]Mawhinney MR,Glasgow RE.Current treatment options for the management of esophageal cancer[J].Cancer Manag Res,2012,4:367-377.

[4]Jemal A,Bray F,Center MM,et al.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2011,61(2):69-90.

[5]Zhao L,Yan X,Shi J,et al.Ethanol extract of Forsythia suspensa root induces apoptosis of esophageal carcinoma cells via the mitochondrial apoptotic pathway[J].Mol Med Rep,2015,11(2):871-880.

[6]Liu GX,Wang TT,Hu WJ,et al.Anticancer effect of ethanol extract of Fructus Forsythiae on primary cancer cells isolated from ascites and pleural fluids[J].Practical Geriatrics,2009,23(5):359-363.

[7]王彩霞，殷海濤,劉寶瑞.連翹三萜類化合物對前列腺癌PC-3細胞增殖抑制及放療敏感性的[J].山東醫藥,2011,51(45):25-27.

[8]雷秋香，趙連梅，顏晰，等．連翹葉乙醇提取物對人食管癌細胞增殖抑制作用的研究[J]．腫瘤防治研究，2012，39(4)：394-399．

[9]顏晰，趙連梅，孫佳瑋，等．連翹提取物體外抗腫瘤活性的初步研究[J]．癌變·畸變·突變，2012，24(1)：20-24．

[10]Li X,Sun J,Hu S,et al.Icariin induced B16 melanoma tumor cells apoptosis,suppressed tumor growth and metastasis[J].Iran J Public Health,2014,43(6):847-848.

[11]Wang Z,Ding L,Zhang S,et al.Effects of icariin on the regulation of the OPG-RANKL-RANK system are mediated through the MAPK pathways in IL-1β-stimulated human SW1353 chondrosarcoma cells[J].Int J Mol Med,2014,34(6):1720-1726.

[12]趙連梅，紀昕，潘曉明，等．淫羊藿苷(ICA)對化療后免疫抑制小鼠的免疫促進作用[J]．中國免疫學雜志，2009，25(12)：1092-1095.

[13]趙連梅，紀昕，單保恩，等．淫羊藿苷對化療后小鼠骨髓和細胞免疫抑制作用的影響[J]．細胞與分子免疫學雜志，2010，26(10)：976-979．

[14]王謙，張玲，毛海婷，等．中藥淫羊藿苷逆轉肝癌HepG2.2.15細胞惡性表型及誘導分化研究[J]．世界華人消化雜志，2007，15(19)：2087-2092．

[15]李翠玲，張玲，顧洪濤，等．淫羊藿苷體內抑瘤作用及其機制[J]．中國腫瘤生物治療雜志，2007，14(2)：137-142．

[16]Wurzer WJ,Ehrhardt C,Pleschka S,et al.NF-kappaB-dependent induction of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) and Fas/FasL is crucial for efficient influenza virus propagation[J].J Biol Chem,2004,279(30):30931-30937.

[17] Reichmann E.The biological role of the Fas/FasL system during tumor formation and progression[J].Semin Cancer Biol,2002,12(4):309-315.

[18]Elnemr A,Ohta T,Yachie A,et al.Human pancreatic cancer cells disable function of Fas receptors at several levels in Fas signal transduction pathway[J].Int J Oncol,2001,18(2):311-316.

Icariin induces apoptosis of esophageal cancer cell through enhancing Fas-FasL expression activity*

JiXin1,WangChong1,LiJie2,YueXiaole1,ZhangYanhua3,LiYongjun1△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,SecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang,Hebei050000,China;2.ScientificResearchCenter,FourthHospitalofHebeiMedicalUniversit,Shijiazhuang,Hebei050011,China;3.DepartmentofClinicalLaboratory,XinjiMunicipalFirstHospital,Xinji,Hebei052300,China)

ObjectiveTo investigate the inhibitory effect of icariin(ICA) on the xenograft tumors growth of esophageal carcinoma and to preliminarily investigate its mechanism.MethodsThe MTT assay and Giemsa staining were applied to detect and observe the in vitro inhibitory effect of ICA on esophagus cancer cell lines Eca-109 and TE-13.The xenograft tumor model of nude mouse esophagus cancer cell was constructed and divided into 3 groups,6 cases in each group.Each mouse in the experimental group was intraperitoneally injected by ICA 50 mg/kg;while the control group was injected by the same volume of normal saline and the positive control group was injected by cis-platinum 2 mg/kg,once every 2 days,a total of 14 days.The tumor volume was measured once per 3 d.After experiment,the tumor weight was measured;the TUNEL staining was used to observe the morphological changes and cell apoptosis of tumor tissue in each group.The changes of Fas and FasL protein expression in tumor tissues were analyzed by immunohistochemistry.The FasL and IFN-γ levels in peripheral blood were tested by the ELISA assay.ResultsICA exerted no obvious inhibitory effect on the proliferation of Eca-109 and TE-13 cell in vitro.The average volume and weight of xenografts tumor had statistical difference between the experimental group and the positive control group (P<0.05).The TUNEL staining results showed that the tumor tissues had obvious apoptosis,the number of apoptosis cells was significantly increased compared with the control group(P<0.05).The immunohistochemistry experimental results showed that the expression of Fas and FasL was significantly increased(P<0.05).The ELISA experimental results demonstrated that the FasL and IFN-γ levels of peripheral blood in the experimental group were significantly increased(P<0.05).ConclusionICA had no obvious inhibitory effect on esophageal cancer cell proliferation in vitro,but could induce in vivo apoptosis through the Fas expression and secretion of FasL and IFN-γ,thus plays the role of anti-esophageal cancer.

icariin;esophageal neoplasms;Fas-FasL;apoptosis

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.12.008

河北省中醫藥管理局科研計劃課題(2015124)。作者簡介：紀昕(1980-)，主管檢驗師，碩士，主要從事臨床生物化學和免疫學檢驗研究?！?/p>

，E-mail:lyjj221@sina.com。

R735.1

A

1671-8348(2016)12-1608-04

2015-11-18

2015-12-28)