肝細胞癌組織中高爾基體蛋白73和轉化生長因子β1及Smad2的表達水平及其意義

黃風玲，楊 穎，張瑞麗，毛 睿，劉 攀，孫 毅，張 華，包永星

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肝細胞癌組織中高爾基體蛋白73和轉化生長因子β1及Smad2的表達水平及其意義

黃風玲，楊 穎，張瑞麗，毛 睿，劉 攀，孫 毅，張 華，包永星

目的探討高爾基體蛋白73(GP73)及轉化生長因子β(TGF-β)/Smads信號通路與肝細胞癌(肝癌)的關系。方法選取2010年1月—2014年12月新疆醫科大學第一附屬醫院病理科收集的80例肝癌患者的肝癌組織及癌旁組織蠟塊標本，并從本院病案室調閱患者的臨床病歷資料，包括性別、年齡、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、血清甲胎蛋白(AFP)水平、有無肝硬化、有無門靜脈癌栓、分化程度、TNM分期、有無血管侵犯。采用免疫組織化學EnVision二步法檢測肝癌組織和癌旁組織GP73、TGF-β1和Smad2的陽性表達情況和積分光密度(IOD)。結果GP73定位于胞質，呈棕黃色顆粒。肝癌組織GP73陽性表達率為73.8%(59/80)，高于癌旁組織的5.0%(4/80)(χ2=76.50，P<0.05)。TGF-β1和Smad2主要表達于胞質，偶見于胞核，為棕黃色深染顆粒。肝癌組織TGF-β1陽性表達率為81.2%(65/80)，高于癌旁組織的6.2%(5/80)(χ2=65.67，P<0.05)；肝癌組織Smad2陽性表達率為66.2%(53/80)，高于癌旁組織的10.0%(8/80)(χ2=47.62，P<0.05)。Spearman相關分析結果顯示，GP73與TGF-β1、Smad2呈正相關(rs=0.841、0.405，P<0.05)。不同性別患者肝癌組織GP73、Smad2表達水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，TGF-β1表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)；不同年齡、HBsAg、AFP、有無肝硬化及門靜脈癌栓患者肝癌組織GP73、TGF-β1和Smad2表達水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；不同分化程度、TNM分期、有無血管侵犯患者肝癌組織GP73、TGF-β1和Smad2表達水平比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。結論GP73在肝癌組織中多呈陽性表達，其可能通過調控TGF-β/Smads信號通路參與肝癌的發生與發展。

癌，肝細胞；轉化生長因子β1；Smad2蛋白質；高爾基體蛋白73

黃風玲，楊穎，張瑞麗，等.肝細胞癌組織中高爾基體蛋白73和轉化生長因子β1及Smad2的表達水平及其意義[J].中國全科醫學，2016，19(26)：3191-3195.[www.chinagp.net]

HUANG F L，YANG Y，ZHANG R L，et al.Expression level and significance of GP73，TGF-β1and Smad2 in hepatocellular carcinoma tissues[J].Chinese General Practice，2016，19(26)：3191-3195.

肝細胞癌(肝癌)是人類最常見的惡性腫瘤之一，根據全球最新數據統計，肝癌發病率在全身惡性腫瘤中位居第6位，病死率位居第2位；在我國形勢更加嚴峻，發病和死亡人數占全球50%以上，堪稱肝癌大國[1]。高爾基體蛋白73(Golgi protein 73，GP73)是一種新穎的Ⅱ型高爾基體跨膜糖蛋白，是潛在的肝癌血清腫瘤標志物，然而其在肝癌發生、發展中的功能及調節機制尚罕見報道。轉化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)是一種多功能的細胞因子，其介導的TGF-β/Smads信號通路與多種腫瘤的發生及侵襲、轉移密切相關。本研究采用免疫組織化學染色的方法，對肝癌組織及癌旁組織中GP73、TGF-β1和Smad2的表達水平進行檢測，從組織學水平上初步探討GP73及TGF-β/Smads信號通路與肝癌發生/發展的可能機制，為進一步在分子學水平上探討肝癌發病機制提供理論依據。

1　材料與方法

1.1組織標本經新疆醫科大學第一附屬醫院倫理委員會批準，選取2010年1月—2014年12月新疆醫科大學第一附屬醫院病理科收集的80例肝癌患者的肝癌組織及癌旁組織蠟塊標本，并從本院病案室調閱該80例患者的臨床病歷資料，包括性別、年齡、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、血清甲胎蛋白(AFP)水平、有無肝硬化、有無門靜脈癌栓、分化程度、TNM分期、有無血管侵犯。80例患者病歷資料完整；術前均未行放療、化療、射頻消融及生物治療等內科治療，術后病理學確診為肝癌；組織蠟塊均經病理科兩名資深醫生進行HE染色，形態符合肝癌確診依據[2]。

1.2方法

1.2.1主要試劑與儀器兔抗人GP73多克隆抗體購自美國Proteintech Group公司，兔抗人TGF-β1多克隆抗體

1.2.2GP73、TGF-β1和Smad2檢測采用免疫組織化學EnVision二步法檢測肝癌組織和癌旁組織GP73、TGF-β1和Smad2的表達情況。組織標本常規石蠟包埋，5 μm厚連續切片。石蠟切片經烤箱脫蠟后水化，3% H2O2阻斷內源性過氧化物酶，微波爐枸櫞酸抗原修復液修復，冷卻后滴加一抗4 ℃冰箱過夜。每批實驗均設陽性和陰性對照，其中陽性對照為兔抗人GP73多克隆抗體、兔抗人TGF-β1多克隆抗體和兔抗人Smad2多克隆抗體，陰性對照為不加抗體的PBS；一抗工作液體濃度均為1∶50。次日滴加辣根過氧化物酶標記的二抗，37 ℃溫箱孵育30 min，光鏡下觀察二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染，脫水，透明，中性樹膠封固，鏡下觀察。

1.2.3結果判定(1)由兩名病理科醫生根據染色強度獨立進行結果判定，以胞質顯色為棕黃色至棕褐色顆粒為陽性細胞；按照著色強度評分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。使用ImageJ2x圖像分析軟件計算每個視野下陽性部位面積的百分比，每張切片隨機選擇5個視野，取其平均值為該張切片的陽性表達面積；按照陽性表達面積百分比評分：無陽性表達面積為0分，1%～20%為1分，21%～50%為2分，51%～80%為3分，>80%為4分。兩項得分相乘，0～1分為“-”，2～4分為“+”，5～7分為“++”，8～12分為“+++”。將“-～+”定義為蛋白低表達即陰性表達，將“++～+++”定義為蛋白高表達即陽性表達。(2)應用CMIAS真彩色醫學圖像分析系統，每張切片隨機選擇5個高倍(×200)視野，分別對各組5個視野中的免疫組織化學結果進行積分光密度(integral optical density，IOD)測定，然后計算平均IOD。

2　結果

2.1肝癌組織和癌旁組織GP73、TGF-β1和Smad2陽性表達率比較GP73定位于胞質，呈棕黃色顆粒(見圖1，本文彩圖詳見本刊官網www.chinagp.net電子期刊相應文章附件)。肝癌組織GP73陽性表達率為73.8%(59/80)，癌旁組織GP73陽性表達率為5.0%(4/80)，兩者GP73陽性表達率比較，差異有統計學意義(χ2=76.50，P<0.05)。TGF-β1和Smad2主要表達于胞質，偶見于胞核，為棕黃色深染顆粒(見圖2、3)。肝癌組織TGF-β1陽性表達率為81.2%(65/80)，癌旁組織TGF-β1陽性表達率為6.2%(5/80)，兩者TGF-β1陽性表達率比較，差異有統計學意義(χ2=65.67，P<0.05)；肝癌組織Smad2陽性表達率為66.2%(53/80)，癌旁組織Smad2陽性表達率為10.0%(8/80)，兩者Smad2陽性表達率比較，差異有統計學意義(χ2=47.62，P<0.05)。

2.2肝癌組織GP73與TGF-β1、Smad2的相關性Spearman相關分析結果顯示，GP73與TGF-β1、Smad2呈正相關(rs=0.841、0.405，P<0.05)。

2.3不同臨床特征患者肝癌組織GP73、TGF-β1和Smad2表達水平比較不同性別患者肝癌組織GP73、Smad2表達水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，TGF-β1表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)；不同年齡、HBsAg、AFP、有無肝硬化及門靜脈癌栓患者肝癌組織GP73、TGF-β1和Smad2表達水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；不同分化程度、TNM分期、有無血管侵犯患者肝癌組織GP73、TGF-β1和Smad2表達水平比較，差異均有統計學意義(P<0.05，見表1)。

圖1　GP73在肝癌組織及癌旁組織中的表達(免疫組織化學DAB顯色，×400)

Figure1ExpressionofGP73inhepatocellularcarcinomatissuesandpara-carcinomatissues

圖2　TGF-β1在肝癌組織及癌旁組織中的表達(免疫組織化學DAB顯色，×400)

圖3　Smad2在肝癌組織及癌旁組織中的表達(免疫組織化學DAB顯色，×400)

3　討論

表1　不同臨床特征患者肝癌組織GP73、TGF-β1和Smad2表達水平比較±s)

注：IOD=積分光密度，GP-73=高爾基體蛋白73，TGF-β1=轉化生長因子β1，HBsAg=乙型肝炎表面抗原，AFP=甲胎蛋白

GP73是一種新近發現的Ⅱ型高爾基體跨膜糖蛋白，因其在十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳中顯示相對分子量為7.3×104而得名。2000年，KLADNEY等[3]在構建成人巨大細胞性肝炎(giant cell hepatitis，GCH)時首次發現GP73，進一步研究發現，在病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、酒精性肝硬化患者肝組織中GP73的表達明顯高于正常組[4]。2004年，MAITRA等[5]研究發現GP73可以在血清中檢測到，并認為GP73可以作為肝臟疾病的標志物。在亞洲人群的研究中，毛一雷等[6]初步確立了我國正常人GP73參考范圍，并說明GP73不但可以作為診斷肝癌的敏感性指標，而且對預測預后有一定的價值。同時，本課題組前期研究也證實血清GP73水平在肝癌患者中升高最為明顯，臨床上認為其可能成為肝癌早期診斷的理想標志物[7-9]。

2011年腫瘤權威教授CHAFFER等[10]指出腫瘤細胞只有發生上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)具備了運動侵襲能力，才能進行局部浸潤和遠處轉移。因此研究肝癌發生EMT的關鍵分子及信號通路對阻斷肝癌細胞侵襲、轉移的發生和發展有非常重要的意義。2013年本課題組就GP73在肝癌發生、發展中的調節機制進行初步研究發現，GP73與EMT關系密切，發生EMT的主要分子特征是上皮細胞標志物如E-鈣黏蛋白(E-cadherin)表達下調和間質細胞標志物如波形蛋白(Vimentin)表達上調[11-12]。2014年ZHANG等[13]首先報道在肝癌細胞株HepG2及BEL-7402中應用siRNA對GP73進行干擾后亦提示GP73在肝癌發生、發展的機制中起到重要作用。目前盡管國內外學者對GP73作為肝癌相關性蛋白的研究已取得一定進展，但是，絕大多數研究僅停留在GP73作為肝癌血清腫瘤標志物的方向，其在肝癌發生、發展中的功能及調節機制未明確闡明，嚴重阻礙其臨床價值的轉化。

EMT的發生涉及多個環節，其分子通路十分復雜，但在誘導EMT發生的眾多細胞因子和轉錄因子中，TGF-β被證實是誘導EMT的關鍵因子，TGF-β共有3種，即TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，其中TGF-β1在腫瘤中主要參與刺激細胞生長、誘導細胞分化和凋亡等精細調節活動，近年來諸多研究報道TGF-β能夠誘導體內、體外多種腫瘤細胞發生EMT，認為腫瘤細胞系中轉入外源性TGF-β后獲得EMT特征，侵襲、轉移能力增加；反之抑制TGF-β信號通路后能逆轉EMT的發生，抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移[14-15]。TGF-β在EMT中起著中心作用，即腫瘤轉移的關鍵分子事件。TGF-β介導EMT主要涉及Smad依賴[16]和Smad非依賴[17]兩條信號通路。在Smad依賴信號通路中，TGF-β與細胞膜上Ⅱ型受體結合，Ⅱ型受體激酶誘導Ⅰ型受體磷酸化，并與Smad2/3形成復合物。Smad2/3磷酸化后，與Smad4形成異三聚體或四聚體，使E-cadherin表達下調和Vimentin表達上調，介導EMT發生。因此本研究采用免疫組織化學染色的方法在組織學水平初步探討GP73與TGF-β/Smads信號通路的關系。本研究結果顯示，80例組織蠟塊中GP73和TGF-β1、Smad2在肝癌組織中陽性表達率高于癌旁組織，并且Spearman相關分析顯示，在肝癌組織中GP73與TGF-β1、Smad2均呈正相關，GP73、TGF-β1和Smad2表達水平與肝癌的分化程度、TNM分期及血管侵犯關系密切。

綜上所述，本研究結果表明，GP73的表達與TGF-β/Smads信號通路關系密切，但其具體作用機制及是否還有其他信號通路的參與，進而調節肝癌的發生與發展，有待進一步的分子水平實驗研究加以證實。

作者貢獻：黃風玲、楊穎進行實驗設計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負責；張瑞麗、毛睿、劉攀、孫毅、張華進行實驗實施、評估、資料收集；包永星進行質量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：賈萌萌)

Expression Level and Significance of GP73，TGF-β1and Smad2 in Hepatocellular Carcinoma Tissues

HUANGFeng-ling，YANGYing，ZHANGRui-li，MAORui，LIUPan，SUNYi，ZHANGHua，BAOYong-xing.TumorCenter，theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity，Urumqi830054，China

Correspondingauthor：BAOYong-xing，TumorCenter，theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity，Urumqi830054，China；E-mail：baoyx@vip.sina.com

ObjectiveTo investigate the relationship between Golgi protein 73(GP73)，TGF-β/Smads signaling pathway and hepatocellular carcinoma.Methods80 cases of paraffin-embedded samples of hepatocellular carcinoma tissues and para-carcinoma tissues collected by Pathology Department of the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University were selected from January 2010 to December 2014.And clinical data of these patients were consulted from the Medical Records Room of our hospital，including gender，age，hepatitis B surface antigen(HBsAg)，alpha fetoprotein(AFP)level，with or without liver cirrhosis，with or without portal vein tumor thrombus，differentiation degree，TNM staging，with or without vascular invasion.Immunohistochemistry EnVision system was adopted to detect positive expression and IOD of GP73 and TGF-β1，Smad2 in hepatocellular carcinoma tissues and para-carcinoma tissues.ResultsGP73，claybank particles，were located in cytoplasm.The positive expression rate of GP73 in hepatocellular carcinoma tissues was 73.8%(59/80)，higher than 5.0%(4/80)(χ2=76.50，P<0.05) of para-carcinoma tissues.TGF-β1，Smad2 mainly expressing in cytoplasm，occasionally in karyon，were claybank dense granule.TGF-β1positive expression rate in hepatocellular carcinoma tissues was 81.2%(65/80)，higher than 6.2%(5/80)(χ2=65.67，P<0.05)of para-carcinoma tissues.Smad2 positive expression rate in hepatocellular carcinoma tissues was 66.2%(53/80)，higher than 10.0%(8/80)(χ2=47.62，P<0.05)of para-carcinoma tissues.Spearman relevant analysis results showed that GP73 correlated positively with TGF-β1，Smad2(rs=0.841，0.405，P<0.05).The comparison of the expression levels of GP73，Smad2 in patients with different gender were not statistically significant(P>0.05)，the comparison of the expression levels of TGF-β1in patients with different gender was statistically significant(P<0.05)；the comparison of the expression levels of GP73，TGF-β1and Smad2 in patients with different age，HBsAg，AFP，with or without liver cirrhosis，with or without portal vein tumor thrombus were not statistically significant(P>0.05)；the comparison of the expression levels of GP73，TGF-β1and Smad2 in patients with different differentiation degree，TNM staging，with or without vascular invasion were all statistically significant(P<0.05).ConclusionGP73，mainly expressing positively in hepatocellular carcinoma tissues，may be involved in the occurrence and development of hepatocellular carcinoma through the regulation of TGF-β/Smads signaling pathway.

Carcinoma，hepatocellular；Transforming growth factor beta1；Smad2 protein；Golgi protein 73

新疆維吾爾自治區自然科學基金資助項目(2014211C070)

830054新疆烏魯木齊市，新疆醫科大學第一附屬醫院腫瘤中心

包永星，830054新疆烏魯木齊市，新疆醫科大學第一附屬醫院腫瘤中心；E-mail：baoyx@vip.sina.com

R 730.261

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.26.013

2016-01-12；

2016-05-13)