艾灸對動脈粥樣硬化小鼠炎性反應因子及MMP-9的實驗研究

哈　略　趙百孝

(北京中醫藥大學針灸推拿學院，北京，100029)

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專題——艾灸療法的作用機制及創新應用

艾灸對動脈粥樣硬化小鼠炎性反應因子及MMP-9的實驗研究

哈略趙百孝

(北京中醫藥大學針灸推拿學院，北京，100029)

目的：觀察艾灸對ApoE-/-小鼠主動脈內腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細胞介素-10(IL-10)及基質金屬蛋白酶9(MMP-9)的影響，并從抑制炎性反應，穩定動脈粥樣硬化斑塊等角度探討艾灸在防治動脈粥樣硬化中的機制。方法：將48只采用高脂飲食喂養的載脂蛋白E基因敲除小鼠(ApoE-/-小鼠)作為動脈粥樣硬化模型，并隨機分為3組：艾灸組，模型組，藥物對照組。并將16只同齡相同遺傳背景的C57BL/6小鼠作為空白對照組?？瞻捉M、模型組小鼠每天常規抓取、固定，并放置假艾灸裝置。艾灸組小鼠每天抓取固定，并艾灸膻中穴。藥物組小鼠每天采用辛伐他汀0.28 mg/100 g灌胃，所有干預20 min/d，6 d/周，干預14周后犧牲，取材檢測。Elisa法測定主動脈內TNF-α、IL-10、MMP-9的含量。油紅“O”染色觀察胸主動脈病理改變。結果：1)與模型組相比，艾灸組，藥物組小鼠主動脈內TNF-α、MMP-9含量明顯降低(P<0.05)，艾灸組，藥物組之間無明顯差異；與模型組相比，藥物組IL-10水平明顯升高有統計學意義(P<0.05)，艾灸組小鼠主動脈內IL-10呈升高趨勢，但無統計學意義。2)胸主動脈病理改變：與空白組相比，模型組胸主動脈可見明顯的AS斑塊，內膜破壞，中膜增厚，平滑肌細胞破壞變性，管腔變狹窄。相比于模型組，艾灸組及藥物組主動脈病變明顯減輕。結論：1)艾灸可以有效緩解動脈粥樣硬化病變，抑制動脈粥樣硬化斑塊生長；2)艾灸可以抑制體內炎性反應，并具有穩定斑塊的作用

艾灸；斑塊穩定;動脈粥樣硬化；炎性反應因子

近年來，心血管疾病，包括冠心病、缺血性壞死、腹主動脈瘤及眾多腦卒中、心力衰竭導致的死亡事件，已成為人類的首要威脅，而上述疾病的共同病理基礎均和動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)有關。隨著我國老齡化社會的到來，生活水平的提高及飲食結構的改變，AS造成的心腦血管事件已成為我國人民的主要死亡原因之一。AS是一種發生在大中動脈附近的、以脂質堆積、斑塊形成為特點的慢性病理過程，臨床上，AS的存在是多種心腦血管疾病發生發展的基礎。因此，探索AS的發病機制、研究其病理過程中的重要致病因素，可以指導臨床更好的控制心腦血管疾病。

在解釋AS發病機制的眾多假說中，脂質浸潤假說長期占主導地位。這一現象一度持續了半個世紀[1]。1999年，ROSS在他先前提出的損傷反應假說的基礎上，進一步完善其理論，認為AS的病理過程是一種慢性炎性狀態，炎性反應貫穿AS的始終[2]。雖然目前公認LDL是AS的重要始動因素，但在過去的20多年，免疫和炎性反應機制越來越受到人們的重視[2-3]，越來越多的研究也充分證實了炎性反應在AS過程中扮演著重要角色，這也是現階段AS相關研究的重要切入點。

目前，臨床上用于控制AS的藥物主要包括降血脂藥物，如苯氧酸類、煙酸類及他汀類；抗氧化劑及抗血小板聚集藥等，但長期使用這些藥物，人體會產生不同程度的不良反應。因此，尋求更加安全的補充替代療法，也成為了對抗AS的必要途徑之一。

艾灸療法作為中醫療法的重要組成部分，長期在人民的醫療和養生領域發揮著重要作用，國內相關研究及本課題組前期研究均證明，艾灸可以通過調節脂肪、膽固醇代謝等途徑和抑制炎性反應等環節來抑制AS的病理發展。因此，本實驗旨在觀察艾灸對AS模型小鼠主動脈病理、炎性因子及基質金屬蛋白酶的作用，探討艾灸在AS過程中的抗炎機制及其穩定斑塊的作用。

1　實驗材料

1.1實驗動物本實驗選用8周齡健康雄性載脂蛋白E基因敲除小鼠(ApoE-/-小鼠)作為AS模型，同齡相同遺傳背景非轉基因野生C57BL/6小鼠作為空白對照。小鼠均購于北京維通利華實驗動物有限公司。ApoE-/-小鼠采用高脂飼料喂養，(飼料購自北京維通利華實驗動物有限公司，含15%豬油、2%膽固醇、0.05%膽酸)，C57BL/6小鼠采用常規飼料喂養。所有小鼠均可自由進食飲水；飼養環境溫度為(23±2)℃,濕度為50%～60%左右。采用人工控制室內照明,保持12 h光照(8：00—20：00)和黑暗(20:00—次日8:00)交替循環。

1.2主要試劑和儀器1)特制細艾條：規格φ0.5 cm×20 cm,購自河南南陽漢醫艾絨有限公司；2)辛伐他汀購自廣東杭州默沙東制藥有限公司;3)小鼠固定器：規格150 mm×65 mm×50 mm，可固定小鼠頭、尾、四肢部位，底板處設有小孔，可暴露胸部，購自上海華巖儀器設備有限公司；4)小鼠灌胃針：規格：12號總長40 mm彎針，購自北京百諾威生物科技有限公司；5)低溫離心機，德國ZK380型；6)超低溫冰箱，日本三洋公司產；7)電子天平，河南愛博科技發展有限公司LEICA CM1850冰凍切片機；8)Leica RM2235石蠟切片機；9)Leica冰凍組織包埋劑；10)Leica HI1220烤片機；11)Leica ST5020全自動組織脫水機；12)顯微鏡：Nikon E200光學顯微鏡；13)拍照系統：佳能450D相機；14)Olympus bx51顯微鏡；15)腫瘤壞死因子(TNF-α)酶聯免疫吸附測定(Elisa)試劑盒，購武漢華美生物工程有限公司，產品編號(CSB-E04741m)；白細胞介素10(IL-10)酶聯免疫吸附測定(Elisa)試劑盒，購武漢華美生物工程有限公司，產品編號(CSB-E04594m)；基質金屬蛋白酶9(MMP9)；酶聯免疫吸附測定(Elisa)試劑盒，購武漢華美生物工程有限公司，產品編號(CSB-E08007m)。

2　實驗方法

2.1動物分組及處理將48只8周齡ApoE-/-小鼠隨機分為3組：模型對照組，西藥組，艾灸組，每組16只。16只C57BL/6作為空白對照。適應性喂養1周后，開始進行實驗干預。干預14周后，犧牲取材，檢測指標。

2.2干預方法空白組：將小鼠抓取、放入固定器，固定小鼠頭、尾、四肢部位(1次/d)。

模型組：將小鼠抓取、放入固定器，固定小鼠頭、尾、四肢部位(1次/d)。

西藥組：將小鼠抓取，采用辛伐他汀懸液灌胃2.8 mg/kg(1次/d)。

艾灸組：將小鼠抓取，放入固定器固定，固定小鼠頭、尾、四肢部位。固定完成后將固定器后架起，固定器底部設有小孔，暴露胸部膻中穴，點燃艾條并放置在小鼠胸部下方，使熱力通過固定器底部小孔傳至小鼠胸部膻中穴。在艾灸過程中，不斷調整艾條高度，使艾灸的溫度基本保持恒定。艾灸干預20 min/次，1次/d，6 d/周，共14周，在干預14周末犧牲小鼠，取材。

2.3取材及檢測末次干預后，禁食不禁水12 h。每組隨機選取8只小鼠，測量體重后，用3.5%的水合氯醛0.1 mL/10 g腹腔注射麻醉后，迅速剖開胸部，暴露心臟，心臟取血后，使用20 mL注射器經心尖偏左3～4 mm處進針，插入左心室，并剪開右心耳，灌注4 ℃ 0.9% NaCl溶液20～30 mL，待肺部、肝臟、腎臟顏色明顯變白，流出液體澄清后，從主動脈弓起，沿脊柱分離主動脈，沖洗，取出主動脈。濾紙吸干后稱重100 mg,制成10%動脈勻漿3 000 r/min離心10 min后取上清,保存于-80 ℃待測。剩余8只取出主動脈后立即使用PBS緩沖液反復沖洗數次，放入4%多聚甲醛中固定24 h。選取胸腔主動脈部位做油紅“O”染色。

胸主動脈油紅“O”染色：

1)組織包埋與切片：固定后，進行梯度蔗糖脫水，10%蔗糖2 h，20%蔗糖2 h，30%蔗糖直至組織沉底后取出，濾紙吸干殘余液體，投入LEICA冰凍組織包埋劑中浸泡5 min使氣泡排盡，使組織立于包埋臺，LEICA包埋劑包埋后立即速凍，使用LEICA CM1850冰凍切片機在恒溫-20 ℃環境下進行6 μm冰凍切片，切片后自然風干，準備油紅“O”染色。

2)油紅“O”染色：切片蒸餾水浸洗5 min；60%異丙醇浸泡1 min；油紅“O”染色液浸染5 min，自來水沖洗掉殘余染色液；放入異丙醇內分化至脂滴周邊組織無色后水洗終止。蘇木素復染3 min；氨水返藍后甘油封片指甲油封固后自然風干。

采用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定主動脈勻漿中的TNF-α、IL-10、MMP9，具體操作步驟如下：

1)將各種試劑移至室溫(18～25 ℃)環境中平衡，按前述方法配制試劑，備用。

2)加樣：分別設標準品孔、待測樣本孔。每孔分別加100 μL標準品或待測樣本，輕輕晃動混勻，覆上板貼，37 ℃孵育2 h。

3)棄去液體，甩干，不用洗滌。

4)每孔加生物素標記抗體工作液100 μL，覆上新的板貼，37 ℃孵育1 h。

5)棄去孔內液體，甩干，洗板3次。每次浸泡2 min，200 μL/孔，甩干。

6)每孔加HRP-鏈酶親和素工作液100 μL，覆上新的板貼，37 ℃孵育1 h。

7)棄去孔內液體，甩干，洗板5次。每次浸泡2 min，200 μL/孔，甩干。

8)每孔加底物溶液90 μL，覆上新的板貼，37 ℃避光孵育15～30 min。

9)依序每孔加終止溶液50 μL，終止反應。

10)在反應終止后5 min內用酶標儀在450 nm波長依序測量各孔的光密度(OD值)。

11)以標準品的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標做標準曲線。根據樣本OD值，計算出相應的濃度。計算所得數值除以蛋白濃度為每mg蛋白中含有的樣品濃度。

3　結果

3.1主動脈病理形態見圖1～圖4。

圖1　空白組(×10)

注：血管完好，內皮細胞完整，內膜未見增厚，管腔大小正常，未見AS斑塊形成，細胞形態正常。

3.2主動脈炎性反應因子及基質金屬蛋白酶9(MMP-9)水平

3.2.1各組主動脈勻漿中TNF-α的含量比較各組主動脈勻漿中TNF-α水平呈空白組<艾灸組<西藥組<模型組的趨勢。模型組小鼠主動脈內TNF-α含量顯著高于空白組(P<0.01)。與模型組相比，艾灸組、西藥組小鼠主動脈內TNF-α含量顯著低于模型組(P=0.022,0.003)；艾灸組與西藥組相比，TNF-α水平無統計學意義(P=0.377)。

圖2　模型組(×10)

注：可見主動脈壁有明顯的斑塊形成，內皮細胞破裂、內膜增厚明顯，彈力纖維斷裂，中膜增厚、平滑肌細胞增生。粥樣硬化斑塊形成、斑塊內可見較多脂肪滴，管腔狹窄。

圖3　西藥組(×10)

注：有斑塊形成，但病變較輕，內皮細胞被破壞，但內膜、中膜增厚不明顯，彈力纖維未斷裂，中膜完整。斑塊內有明顯脂滴形成。

圖4　艾灸組(×10)

注：有斑塊形成，斑塊內可見明顯脂滴，內膜細胞被破壞，中膜增厚，部分中膜被破壞，彈力纖維斷裂。

3.2.2各組主動脈勻漿中IL-10的含量比較各組主動脈勻漿中IL-10水平呈正常組>西藥組>艾灸組>模型組的趨勢。與正常組相比，模型組小鼠血清IL-10含量顯著低于正常組(P<0.01)；與模型組相比，西藥組小鼠主動脈內IL-10含量顯著升高(P<0.01)，艾灸組含量升高無統計學意義，但統計學顯示有一定的升高趨勢(P=0.053)。

表1　各組主動脈內TNF-α含量對比

注：與模型組相比*P<0.05;**P<0.01。

圖5　各組主動脈內TNF-α含量對比(pg/mg)

注：與模型組相比*P<0.05;**P<0.01。

表2　各組主動脈內IL-10含量對比

注：與模型組相比*P<0.05;**P<0.01。

圖6　各組主動脈內IL-10含量對比(pg/mL)

注：與模型組相比*P<0.05;**P<0.01。

3.2.3各組中動脈勻漿中MMP-9的含量比較各組主動脈內MMP-9含量表現為：空白組<艾灸組<西藥組<模型組。模型組小鼠主動脈內MMP-9含量顯著高于空白組(P<0.01)。與模型組相比艾灸組、西藥組小鼠主動脈內MMP-9含量顯著低于模型組(P=0.015,0.003)；艾灸組與西藥組相比，MMP-9水平無統計學意義(P=0.515)；具體數據見表3、圖7。

表3　各組小鼠主動脈內MMP-9含量比較

注：與模型組相比*P<0.05;**P<0.01。

圖7　各組小鼠主動脈內MMP-9含量比較(ng/mg)

注：與模型組相比*P<0.05;**P<0.01。

4　討論

TNF-α是肽介質家族的一員，具有很強的促炎特性，在適應性免疫、細胞增殖及凋亡的過程中扮演著重要角色。很多細胞都可以分泌TNF-α，如：巨噬細胞，單核細胞，平滑肌細胞及纖維母細胞。TNF-α在AS中對脂質具有質量與數量的雙重影響，脂質的這種持續被修飾，可推進AS的不斷進展。其對脂質代謝的影響主要是通過降低膽固醇7α-羥化酶[4]及脂蛋白脂酶的分泌，及刺激肝臟生成三酰甘油[5-7]來實現的；而在炎性反應過程當中，TNF-α參與了AS過程當中的全部階段，而AS過程中的每個階段都伴有不同程度的炎性反應，TNF-α還可與其他炎性反應因子，趨化因子一起形成協同作用，參與介導內皮細胞黏附分子的表達，血小板聚集，炎性反應細胞的激活和聚集，以及血管壁內部的炎性反應級聯反應，從而推動AS的發展[6,8]。在AS的早期病變，TNF-α通過下調NO分泌、介導VCAM-1及ICAM-1而誘導平滑肌細胞增值[9]、上調各種趨化因子、半胱天冬酶，使內皮損傷不斷加重。而在AS發展階段，TNF-α通過不斷誘導各種炎性反應因子的分泌，加重AS過程中的炎性反應級聯反應。在AS的后期，TNF-α又能上調基質金屬蛋白酶MMP的含量，降低斑塊穩定性，從而增加急性心血管事件的發生的幾率[10]。

白細胞介素10(IL-10)作為一種抗炎因子，主要由巨噬細胞及Th2亞型的T淋巴細胞分泌，它的主要功能包括抑制巨噬細胞活性、MMP和促炎因子的表達。研究表明持續的炎性反應刺激巨噬細胞分泌IL-10，從而抑制各種炎性反應因子的表達，如：IL-1、TNF-α、IL-8，并且誘導IL-1受體拮抗劑的增多[11-12]。同時，IL-10對MCP-1的抑制作用[13]，也被認為是其對抗AS病理變化的重要機制。這2個指標，是AS過程中的典型炎性反應因子，一定程度上反映了炎性反應的活躍程度。在本實驗中，艾灸對TNF-α及IL-10的良性調節作用證明，艾灸膻中穴可以對小鼠AS過程產生廣泛的抗炎作用。

人類AS過程中，當出現纖維帽變薄、SMC減少、脂類核心擴大、鈣化、基質重組等特征時，斑塊就會不穩定[14]，從而為急性心血管事件的發生創造條件。當斑塊受到外力時，承受其機械應力的部位就是纖維帽，主要有膠原纖維、蛋白多糖、彈性蛋白組成。纖維帽的完整性與抗機械力的作用于EMC密不可分；而膠原纖維是構成EMC的核心物質，有SMC合成，MMPs降解。MMPs升高后，對膠原纖維的分解作用加強，導致纖維帽變薄，再加上血流動力學的應激變化，最終使斑塊發生破裂，故認為MMPs增多與斑塊不穩定性密不可分[14-15]。MMP-9主要由中性粒細胞、巨噬細胞分泌，分泌的形式是前酶原形式?？梢灾苯幼饔糜谘軆绕せ啄V型膠原，導致其分解。本實驗觀察艾灸對ApoE-/-小鼠MMP-9的影響，在國內尚屬首例，結果表明，與模型組相比，艾灸能顯著降低主動脈內MMP-9的含量，提示艾灸在促進斑塊穩定性上有積極的干預效果。但由于MMP-9受多種細胞因子影響，艾灸對其調控的具體機制還不得而知，可能是基于其對其他炎性反應因子的抑制，影響MMP-9的分泌，或者是另外單獨的調控通道，這有待下一步更細致的研究。

艾灸，作為一種中醫外治法。一般我們認為其起效因素主要有以下3點：1)艾燃燒生成物本身的藥理作用；2)艾灸燃燒產生的物理作用，光熱效應；3)經絡穴位自身的調控作用。

首先我們來看下穴位的功效，在本研究中，所選用的膻中穴主治上焦病癥，是經絡腧穴理論中的重要穴位之一，對其進行刺激，可以增強上焦的氣化功能，乃至全身的氣化功能，促進水谷的輸布，減少痰、瘀等病理產物的形成和堆積。而穴位本身所具有的寬胸理氣，行氣活血的功效，可以增強AS過程中有害因子的代謝和輸送，保護內皮細胞，改善病理環境，這是穴位自身的功效。

溫熱刺激是艾灸療法的主要作用機制之一，其溫通經脈、活血化瘀的功效也正是通過溫熱刺激的方式來實現的，炎性反應過程中的紅、腫、痛等特征也符合中醫理論中“瘀”的表現，而艾灸正是通過活血化瘀的作用來疏通血脈，使局部或者機體內瘀滯的氣血得以流通，改善組織代謝，調節微循環，促進病理產物的排除。施灸局部是艾灸作用的直接對象,是艾灸溫通效應啟動機制的關鍵環節。在本研究中，艾條點燃后直接放置于胸部穴位，熱力可以穿透胸腔，直達心脈，因此，除了穴位本身的治療作用以外，艾灸的溫熱效應是本次研究的重要渠道。

艾燃燒生成物是艾灸的起效因素之一，研究組前期觀察不同濃度艾煙對大鼠血清VCAM-1、ICAM-1、hs-CRP的作用，結果表明三種濃度的艾煙均能降低這三種指標的水平[16]。而對AS模型的ApoE-/-小鼠，艾煙能抑制其血清中黏附分子、趨化分子，炎性反應因子的表達，在AS過程中發揮其抗炎的作用[17]。本次實驗，雖然沒有單獨設立艾煙干預組進行對比，但艾煙在治療過程中的作用也不可忽視。另外，課題組前期證明，艾煙可以通過嗅覺通路通路至下丘腦海馬，起到抑制ROS、TNF-α，抑制炎性反應；艾煙本身含有大量的揮發油和芳香物質，筆者設想，艾煙能通過嗅覺通路進入顱內，影響腦內活動，調節交感神經系統，通過心叢神經，作用于心血管系統，可能也是其起效途徑之一，此假設還需要進一步實驗驗證。

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(2016-06-28收稿責任編輯：洪志強)

Experimental Study of Moxibustion′s Effect on Inflammatory Factors and MMP-9 of Arteriosclerosis Mice

Ha Lue, Zhao Baixiao

(SchoolofAcupuncture-MoxibustionandTuinaofBeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

Objective:To observe the effect of moxibustion on TNF-α, IL-10 and MMP-9 of arteriosclerosis mice and discuss its possible mechanism from the angle of inhibiting inflammatory factors and stabilizing plague. Methods: To establish atherosclerosis model by removing ApoE gene through high-fat diet feeding. A total of forty-eight ApoE-/-mice (8 weeks old) were randomly divided into moxibustion group, model group, and medicine control group. Additionally, sixteen same age C57BL/6 mice were used as a blank control. Mice in the blank control and model control group were handled and intervened with sham moxibustion every day. Mice in the moxibustion group were handled and treated with moxibustion on Dan Zhong (RN17) acu-point while the mice in medicine control group were intervened by gavage Simvastatin 0.28 mg/100 g. All the interventions were given 20 min/day, 6 days/week, 14 weeks totally. Then the mice were killed for examination. Elisa method was used to test the level of TNF-α, IL-10, and MMP-9 and red oil “O” stain were used to observe the plague size in the aorta. Results: 1)Compared with the model group, TNF-α, MMP-9 levels of moxibustion group and medicine control group were decreased significantly (P<0.05), and there is no significant difference between the moxibustion group and medicine control group. Compared with the model group, IL-10 levels were increased significantly (P<0.05) in medicine control group. Despite IL-10 levels in moxibustion group showed a trend of increase, no significant difference was shown. 2)The pathological changes in the thoracic aorta plaque: Compared with the blank group, plague in model group can be obviously seen in the thoracic aorta, pathological changes including intimal destruction, medium thickness, smooth muscle cell degeneration, lumen stenosis can also be seen in the model group. Compared with model group, aortic lesions in moxibustion group and medicine group were significantly reduced. Conclusion: 1)Moxibustion could alleviate atherosclerosis, inhibit the growth of plague. 2)Moxibustion could inhibit inflammation in the body, which may be one of the mechanisms of its anti-atherosclerosis effect. Besides, moxibusion also contributes to plaque stability.

Atherosclerosis; Inflammation factors; Moxibustion; Plaque stability

國家自然科學基金項目(編號：81373730)；國家青年自然基金項目(編號：81403449)；國家自然科學基金項目(編號：81574068)；國家國際科技合作專項項目(編號：2011DFA31370)

哈略(1989.04—)，2013級在讀碩士研究生，研究方向：艾灸與艾燃燒生成物的效應機制，E-mail：halue@126.com

趙百孝(1963.03—)，博士，教授，博士研究生導師，北京中醫藥大學針灸推拿學院院長，研究方向：艾灸作用與原理，Tel：(010)64286737，E-mail:baixiao100@vip.sina.com

R245.81

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.08.001