艾灸對ApoE-/-動脈粥樣硬化小鼠肝臟病理及脂質代謝的作用研究

于夢蕓　哈　略　黃　暢　黃薰瑩　趙百孝

(北京中醫藥大學，北京，100029)

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艾灸對ApoE-/-動脈粥樣硬化小鼠肝臟病理及脂質代謝的作用研究

于夢蕓哈略黃暢黃薰瑩趙百孝

(北京中醫藥大學，北京，100029)

目的：觀察艾灸對載脂蛋白基因敲除(ApoE-/-)動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)小鼠肝臟病理及血脂相關指標的影響。方法：48只8周齡ApoE-/-小鼠隨機分為3組：模型對照組(n=16)、艾灸組(n=16)、西藥組(n=16)，16只同齡C57BL/6小鼠作為正常對照，固定器固定正常組、模型組小鼠及艾灸組，并對艾灸組小鼠關元穴(RN4)進行艾灸，西藥組采用辛伐他汀懸液灌胃(2.8 mg/kg)，各組小鼠每天干預20 min，連續干預12周，每周干預6 d，于12周末檢測小鼠血清的總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)及高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量，以油紅“O”染色法觀察各組小鼠肝臟病理形態變化。結果：各組小鼠血清TC含量呈正常組<西藥組<艾灸組<模型組的趨勢，艾灸組及西藥組血清TG含量較模型組顯著降低(P<0.05)，西藥組、艾灸組小鼠血清LDL含量顯著低于模型組(P<0.01；P<0.05)，各組小鼠血清HDL含量呈正常組>西藥組、艾灸組>模型組的趨勢，西藥組和艾灸組之間無統計學意義。油紅染色可見艾灸組和西藥組較模型組肝細胞腫脹程度明顯減輕，少量炎細胞浸潤及少量紅染脂肪滴。結論：艾灸可以降低ApoE-/-小鼠血清TC、TG、LDL含量，升高HDL含量，并對AS過程中的肝臟病理有顯著的良性調節作用，可以通過調節脂代謝的途徑，改善AS。

艾灸；動脈粥樣硬化；脂質代謝

動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是眾多心血管疾病的主要病理基礎。其病變的發生發展是許多因素綜合作用的結果，涉及到多種發病機制，是一個復雜多變的病理過程。AS的本質是一類在大、中型動脈部位發生的，大量脂質和膽固醇聚集并生成纖維斑塊的慢性炎性反應性疾病[1]。長期以來的研究認為，脂質代謝紊亂是動脈粥樣硬化發生發展的重要因素。大量關于脂代謝影響動脈粥樣硬化機制研究顯示，脂質代謝異常，主要表現為血漿膽固醇過高，是導致動脈粥樣硬化損傷的重要危險因素。導致動脈粥樣硬化的脂蛋白主要包括乳糜微粒(CM)，極低密度脂蛋白(VLDL)，殘粒脂蛋白和低密度脂蛋白(LDL)，在動脈內膜局部損傷后，血漿脂質進入動脈內膜，這些脂蛋白可以在血管壁內聚集，在內膜下間隙沉積并且導致脂質的沉積和早期動脈粥樣硬化病變的產生[2]。此外，過多的LDL被氧化修飾，形成ox-LDL可導致血管內皮細胞激活，巨噬細胞泡沫化和早期的動脈粥樣硬化脂質條紋的產生。脂質代謝異常還包括血漿HDL水平下降，引起膽固醇逆運轉能力減退[3]。所以，降脂療法成為抗動脈粥樣硬化的主要戰略，尤其是對LDL的良性調節，更是能起到早期防止AS的作用。目前臨床上采用的最常見常見的降脂藥物是他汀類藥物，它是一種一類羥甲戊二酰輔酶A還原酶(HM-CoA)抑制劑，能夠抑制HM-CoA的還原，阻斷膽固醇酯的合成及其他一些機制，最終實現降低血脂防治AS的作用[4-6]。然而長期的藥物控制，不僅使患者身體產生一定的不良反應，也給患者的生活帶來極大的不便，因此，尋求補充替代療法通過降血脂、調節膽固醇的途徑來防治AS就勢在必行；艾灸是中華傳統醫學的重要組成部分，一直以其經濟、安全、便捷等特點服務于醫療行業。大量的研究已經證實，艾灸可以通過調節血脂而發揮對抗動脈粥樣硬化的作用[7-10]。本實驗以ApoE-/-小鼠作為AS動物模型，以溫和灸作為干預手段，觀察艾灸對動脈粥樣硬化小鼠肝臟病理變化及血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的作用，探討艾灸通過調節脂代謝以起到防止動脈粥樣硬化的作用。

1　實驗材料

1.1實驗動物本實驗選用8周齡載脂蛋白E基因敲除小鼠(ApoE-/-小鼠)作為動脈粥樣硬化模型，同齡相同遺傳背景非轉基因小鼠C57BL/6作為空白對照。小鼠均購自于北京大學醫學部實驗動物科學部。ApoE-/-小鼠采用高脂飼料(購自北京維通利華實驗動物有限公司，含15%豬油、2%膽固醇、0.05%膽酸)，C57BL/6常規飼料喂養。所有小鼠均可自由進食飲水；飼養環境溫度為(22±2)℃,濕度為50%～60%左右。采用人工控制室內照明,保持12 h光照(8：00—20：00)和黑暗(20:00—次日8:00)交替循環。

1.2主要試劑和儀器1)細艾條：規格φ0.5 cm×20 cm,購自河南南陽漢醫艾絨有限公司；2)小鼠固定器：規格150 mm×65 mm×50 mm，可固定小鼠頭、尾、四肢部位，底板處設有小孔，可暴露腹部，購自上海華巖儀器設備有限公司；3)羅氏MODULARP800全自動生化分析儀；4)辛伐他?。嘿徸詮V東杭州默沙東制藥有限公司；5)小鼠灌胃針：規格：12號總長40 mm彎針，購自北京百諾威生物科技有限公司；6)低溫離心機，德國ZK380型；7)超低溫冰箱，日本三洋公司產；8)總膽固醇(TC)試劑盒，三酰甘油(TG)試劑盒，低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒，高密度脂蛋白(HDL-C)試劑盒，購自北京北化康泰臨床試劑有限公司；9)LEICA CM1850冰凍切片機；10)Leica冰凍組織包埋劑；11)Leica HI1220烤片機；12)Leica ST5020全自動組織脫水機；13)顯微鏡：Nikon E200光學顯微鏡；14)拍照系統：佳能450D相機。

2　實驗方法

2.1動物分組及處理48只8周齡ApoE-/-小鼠隨機分為3組：模型對照組，艾灸組，西藥組，每組16只。16只同齡相同遺傳背景C57BL/6作為空白對照。適應性喂養1周后，進行實驗干預。干預方法如下：

正常組：將小鼠放入固定器，固定小鼠頭、尾、四肢部位。

模型組：將小鼠放入固定器固定，固定小鼠頭、尾、四肢部位。

西藥組：將小鼠抓取，采用辛伐他汀懸液灌胃2.8 mg/kg(1次/d)。

艾灸組：將小鼠放入固定器固定，固定器底板處設有小孔，暴露腹部關元穴，將小鼠放入固定器后架起，點燃艾條放置小鼠腹部下方，使灸火透過固定器底部小孔傳至小鼠腹部關元穴。

所有干預20 min/次，1次/d，6 d/周，共12周，在干預12周末犧牲小鼠，取血。

2.2取材及檢測末次干預后，禁食不禁水12 h。小鼠麻醉后，采用眼球摘除法，從眼眶靜脈叢采集血液標本約1.5～2 mL，置于離心管中，靜置1 h后，離心15 min(4 ℃ 1 500 r/min)。離心后將血清保存于-20 ℃冰箱中備用。然后剖開腹部，取出肝臟，沖洗后放入入4%多聚甲醛中固定24 h，做油紅“O”染色。

采用羅氏MODULAR P800全自動生化分析儀檢測TC、TG和LDL-C及HDL-C含量。

3　結果

3.1各組小鼠血清TC、TG、LDL、HDL含量見表1、表2。

表1　各組小鼠TC、TG、含量比較

注：與模型組相比*P<0.05;**P<0.01。

圖1　各組小鼠TC、TG、含量比較

注：與模型組相比*P<0.05;**P<0.01。

各組小鼠血清TC含量呈正常組<西藥組<艾灸組<模型組的趨勢，但組間比較無統計學意義，各組小鼠血清TC含量差異不顯著。

各組小鼠血清TG含量呈正常組<西藥組<艾灸組<模型組的趨勢。與正常組相比，模型組小鼠血清TG含量顯著高于正常組(P<0.05)；與模型組相比，西藥組、艾灸組小鼠血清TG含量顯著低于模型組(P<0.05；P<0.05)；西藥組和艾灸組之間無統計學意義。

表2　各組小鼠LDL、HDL含量比較

注：與模型組相比*P<0.05;**P<0.01。

圖2　各組小鼠LDL、HDL含量比較

注：與模型組相比*P<0.05;**P<0.01。

3.2各組小鼠肝臟病理形態見圖3～圖6。

圖3　1)空白組(X20)　　　圖4　2)模型組(X20)

注:肝細胞排列緊密整齊,細胞核被染為藍色,未見紅染脂滴,無染色陽性細胞。 注:肝索肝竇排列紊亂,肝細胞腫脹變性明顯,肝竇受壓變窄,炎細胞浸潤,可見明顯的紅染脂滴。

圖5　3)西藥組(X20)　　　圖6　4)艾灸組(X20)

注:肝細胞索排列有序,肝細胞腫脹程度明顯減輕,匯管區血管充血,少量炎細胞浸潤,少量紅染脂肪滴。 注:肝細胞索排列有序,肝細胞腫脹程度明顯減輕,匯管區血管充血,少量炎細胞浸潤,少量紅染脂肪滴。

各組小鼠血清LDL含量呈正常組<西藥組<艾灸組<模型組的趨勢。與正常組相比，模型組小鼠血清LDL含量顯著高于正常組(P<0.01)；與模型組相比，西藥組、艾灸組小鼠血清LDL含量顯著低于模型組(P<0.01；P<0.05)；西藥組和艾灸組之間無統計學意義。

各組小鼠血清HDL含量呈正常組>西藥組、艾灸組>模型組的趨勢。與正常組相比，模型組小鼠血清HDL含量顯著低于正常組(P<0.05)；與模型組相比，艾灸組、西藥組小鼠血清HDL含量與模型組無統計學意義(P>0.05)。

4　討論

長期以來，眾多研究者多AS的形成機制展開了深入的研究，而脂質代謝紊亂被認為是AS形成過程中的重要誘因和病理基礎。通常表現為TC、TG、LDL、VLDL水平的升高、HDL水平下降，以及其他相關脂蛋白水平異常(如ox-LDL，ApoA-I)。血漿過量的脂質，可在動脈內膜局部損傷后進入動脈內膜，在血管壁內聚集，在內膜下間隙沉積并且導致脂質的沉積和早期動脈粥樣硬化病變的產生[11]。

膽固醇進入人體后，與載脂蛋白相結合而存在于血漿中。而大部分存在于LDL。當血漿中LDL含量升高，可以破壞血管內皮細胞的靜息狀態，造成內皮細胞的損傷，從而表達黏附因子，吸附單核細胞向血管內皮聚集，從而轉化為巨噬細胞。完成轉化后的巨噬細胞可以對LDL通過攝取、內降解的形式，適當調節血漿膽固醇水平。正常情況下巨噬細胞通過細胞表面LDL-R攝取LDL，LDL受體在脂蛋白的攝取中發揮重要作用[12]，當細胞內膽固醇水平過高時，細胞表面的LDL-R表達下降，以減輕對LDL的攝取，此過程為負反饋調節機制，以維持細胞內的膽固醇平衡[13]。同時LDL很容易被體內活性氧等細胞因子通過氧化修飾、蛋白水解等形式，形成氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)，ox-LDL可以與巨噬細胞表面的清道夫受體特異性結合，進入巨噬細胞[14]。在這個過程當中，ox-LDL快速的、無限制的進入巨噬細胞，超過巨噬細胞自身降解能力，導致巨噬細胞轉化成為泡沫細胞。泡沫細胞不斷堆積，逐漸形成脂肪條紋，這就是AS的早期形成過程。有研究表明，動脈粥樣硬化斑塊中的脂質中，80%來源于泡沫細胞。

HDL是一種球形脂蛋白，由脂質和脂蛋白組成。HDL負責接受細胞流出的膽固醇，并將膽固醇運轉至肝臟，通過膽酸的形式排出。這個過程，被稱作是膽固醇逆轉運。HDL、ApoA-I等通過負責膽固醇的逆轉運，具有抵抗何減輕動脈粥樣硬化的作用[15]。而動脈粥樣硬化中，常表現血漿HDL、ApoA-I水平下降，出現膽固醇的清除障礙。血清中HDL的水平降低，會破壞內環境中的抗炎和抗氧化功效。HDL可以誘導膽固醇結晶的持續凋亡和降解，而LDL和VLDL都不具備這樣的作用。這都說明HDL除了參與膽固醇逆轉運以后，還可以直接降解膽固醇結晶[16-19]。

因此，在本研究中檢測了ApoE-/-小鼠血清TC、TG、LDL、HDL的含量，并觀察了小鼠肝臟病理的變化，以評估艾灸及艾煙干預的降血脂效果。

本次實驗觀察發ApoE-/-小鼠血清TG、LDL、HDL三項指標與正常C57BL/6小鼠差異明顯，ApoE-/-小鼠TG、LDL含量較正常小鼠升高，而HDL含量較正常小鼠下降，這與文獻報道ApoE-/-小鼠可出現自發性脂代謝紊亂相一致，并說明脂質代謝紊亂是ApoE-/-小鼠發生動脈粥樣硬化的機制之一。

而在艾灸對TC這項指標作用的觀察中，各組小鼠之間血清含量無明顯差異，雖然從數值觀察上可以看出，模型ApoE-/-小鼠血清TC含量較正常組略有升高，但是不足以形成統計學差異。這一現象說明本次實驗中ApoE-/-小鼠并未出現明顯的TC改變，這可能是由于本次實驗小鼠的病變并不十分嚴重，未達到顯著水平，可能是造模時間還不夠長，也有可能是實驗采用的模型小鼠自身特點，不易在和TC指標上發生改變。

在對TG、LDL兩項指標的觀察發現，ApoE-/-小鼠在艾灸和西藥干預后，可以出現顯著變化，艾灸及西藥干預3個月，可以顯著降低ApoE-/-小鼠血清TG、LDL含量。對HDL這項指標的觀察發現，艾灸和西藥干預未能引起ApoE-/-小鼠血清HDL含量的明顯改變，盡管從數字上觀察，艾灸和西藥干預HDL含量升高，但不足以形成統計學差異。

中醫學認為，動脈粥樣硬化是一種本虛標實之證，與古籍記載中的“脈痹”病理特點較為一致?！氨咎摗睘闄C體功能減弱，氣虛、陽虛；“標實”為“痰、濁、瘀”等病理產物堆積。艾灸具有溫陽補氣、行氣活血的功效。選取關元穴施灸，可以達到補虛扶陽，溫通血脈的作用，增強機體的氣化功能，一方面使代謝恢復正常，減少病理產物的產生；另一方面，通過其行氣活血的功效，促進“痰、濁、瘀”等病邪的排出。

本研究表明，艾灸可以降低ApoE-/-小鼠血清TC、TG、LDL含量，升高HDL含量，并對AS過程中的肝臟病理有顯著的良性調節作用，可以通過調節脂代謝的途徑，改善ApoE-/-小鼠的AS進程。溫和灸還可以作為AS潛在患者及患者預防和治療的常用手段，可避免長期藥物治療帶來的肝毒性、肌肉損害和神經系統疾病[20]，操作簡便，值得推廣。

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(2016-06-28收稿責任編輯：洪志強)

Effects of Moxibustion on Liver Pathology and Lipid Metabolism in Apolipoprotein E-deficient Mice

Yu Mengyun, Ha Lue, Huang Chang,Huang Xunying,Zhao Baixiao

(BeijingUniversityofChineseMedicine,Bejing100029,China)

Objective:To observe the intervention effects of moxibustion on liver pathology and lipid metabolism in ApoE-/-mice with atherosclerosis. Methods: Forty-eight ApoE-/-mice (8 weeks old) were randomly divided into model group (n=16), moxibustion group (n=16), and medicine group (n=16). Sixteen same age C57BL/6 mice were used as blank controls. Mice in the blank control and model control group were fixed without any treatment. Mice of the moxibustion groups received both fixation and moxibustion on Guanyuan (RN4). Medicine group received simvastatin suspension (2.8 mg/kg) by intragastric administration. All the manipulations were given 20 min each day, 6 days each week, 12 weeks totally. Contents of total cholesterol (TC), triglyceride (TG) and low density lipoprotein cholesterol (LDL-C) and high-density lipoprotein cholesterol (HLD-C) were determined by colorimetric method. Liver pathological changes of mice in each group were observed by oil red “O” staining method. Results: TC content of mice in each group was normal groupmedicine group, moxibustion group>model group. There was no significant differences between medicine group and moxibustion group. There was a remarkable decreasing of swelling degree of liver cells and less infiltration of inflammatory cells and fewer red-stained fat droplets in the moxibustion group and medicine group compared with the model group. Conclusion: Moxibustion can decrease the content of serum TC, TG, LDL and increase the content of HDL in ApoE-/-mice, and significantly regulate the liver pathology in the process of AS, which may be one of the mechanisms for relieving the damage of vascular intima and atherosclerosis by regulating lipid metabolism.

Moxibustion; Atherosclerosis; Lipid metabolism

國家自然科學基金項目(編號：81373730)；國家青年自然基金項目(編號：81403449)；國家自然科學基金項目(編號：81574068)；國家國際科技合作專項項目(編號：2011DFA31370)

于夢蕓，碩士研究生，研究方向：艾灸的作用機理研究，電話：(010)64286737，E-mail:1185706947@qq.com

趙百孝(1963.03—)，博士，教授，博士研究生導師，北京中醫藥大學針灸推拿學院院長，研究方向：艾灸作用與原理，Tel：(010)64286737，E-mail:baixiao100@vip.sina.com

R245.81

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.08.007