芍藥內酯苷、芍藥苷對放射線輻照致血虛小鼠IL-3,GM-CSF,IL-6及TNF-α的影響

王成龍　王林元　王景霞　朱映黎　趙丹萍　張建軍

(北京中醫藥大學,北京,100029)

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芍藥內酯苷、芍藥苷對放射線輻照致血虛小鼠IL-3,GM-CSF,IL-6及TNF-α的影響

王成龍王林元王景霞朱映黎趙丹萍張建軍

(北京中醫藥大學,北京,100029)

目的:研究芍藥內酯苷、芍藥苷對放射線輻照致血虛小鼠的補血作用及對白細胞介素-3(IL-3)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等造血細胞因子的調控機制。方法:采用放射線輻照法復制小鼠血虛模型,灌胃芍藥內酯苷、芍藥苷,檢測小鼠外周血象、胸腺與脾臟指數及分離血清、血漿,分析IL-3、GM-CSF、IL-6、TNF-α的含量。結果:與模型組比較,芍藥內酯苷30 mg/kg組及15 mg/kg組和芍藥苷30 mg/kg組及15 mg/kg組均能升高白細胞值(P<0.01或P<0.05);芍藥內酯苷30 mg/kg組及15 mg/kg組和芍藥苷30 mg/kg組對紅細胞值有升高作用(P<0.05);芍藥內酯苷30 mg/kg組、芍藥苷30 mg/kg組均能明顯升高胸腺指數(P<0.01);芍藥內酯苷30 mg/kg組、芍藥苷30 mg/kg組明顯升高IL-3含量水平(P<0.01);芍藥內酯苷30 mg/kg組及15 mg/kg組和芍藥苷30 mg/kg組均能升高GM-CSF含量水平(P<0.01或P<0.05);芍藥內酯苷30 mg/kg組明顯降低TNF-α含量水平,差異有統計學意義(P<0.01),芍藥苷30 mg/kg組亦能降低TNF-α含量水平(P<0.05)。結論:芍藥內酯苷作為白芍的特征性有效成分,與芍藥苷一致具有補血作用;二者都通過對機體細胞造血因子的調控作用,促進血細胞的生成,維持造血功能的穩定,是白芍養血斂陰功效的物質基礎。

芍藥內酯苷;芍藥苷;放射線輻照法;血虛證;造血細胞因子

白芍[1]有養血斂陰之功,常用于血虛萎黃,月經不調。現代藥理研究表明[2-3],白芍含有單萜及其苷類化合物,其中含量相對較多的2個成分分別為芍藥苷與芍藥內酯苷,中國藥典規定芍藥苷為白芍的標志性成分,但芍藥苷同時也是赤芍的標志性成分[1],文獻對其報道較多,而芍藥內酯苷研究較少[4]。課題組前期研究[4-5]表明芍藥苷、芍藥內酯苷均具有補血作用,芍藥內酯苷為白芍的特征性成分。本實驗通過芍藥內酯苷和芍藥苷對放射線輻照致血虛小鼠的補血作用以及對GM-CSF、IL-3、IL-6與TNF-α影響的研究,探討白芍特征成分芍藥內酯苷及有效成分芍藥苷補血作用的特點及機制。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物雄性昆明種小鼠,體重(20±2) g,購自北京斯貝福(北京)實驗動物科技有限公司提供[許可證號:SCXK(京)2014-0004]。

1.1.2藥物實驗用芍藥內酯苷、芍藥苷:自制,純度均高于96%;陽性藥四物顆粒,吉泰安(四川)藥業有限公司生產,批號:1511133,經本室HPLC測定芍藥內酯苷質量分數為0.329%、芍藥苷質量分數為0.64%。

1.1.3儀器與試劑放射源由軍事醫學科學院放射所提供;Beckman Coulter Ac.T5血細胞分析儀(美國Beckman Coulter Inc);Beckman Coulter Ac.T 5diff Rinse(批號:05202C2),Ac.T 5diff WBC Lyse(批號:20402B),Ac.T 5diff Fix(批號:21802E),Ac.T 5diff Hgb Lyse(批號:06902A2);試劑由北京華英生物技術研究所提供,Stat Fax 2100全自動酶標儀(Awareness Technology Inc.USA);IL-3測試盒:北京華英生物技術研究所(批號:201510730),GM-CSF測試盒:北京華英生物技術研究所(批號:201510730),TNF-α測試盒:北京華英生物技術研究所(批號:201510730),IL-6測試盒:北京華英生物技術研究所(批號:201510730)。

1.2實驗方法

1.2.1動物分組與給藥方法將108只小鼠隨機分成9個組,即空白組,模型組、四物顆粒組(2.5 g/kg相當于人用量15 g/d,2.5 g四物顆粒中含芍藥內酯苷8.225 mg,含芍藥苷16 mg)、芍藥內酯苷組(30 mg/kg、15 mg/kg、7.5 mg/kg)、芍藥苷組(30 mg/kg、15 mg/kg、7.5 mg/kg),每組12只。預防給藥7 d,按每10 g體重灌胃0.2 mL給藥,1次/d。空白組、模型組每天灌胃去離子水。

1.2.2造模方法動物適應性喂養5 d后,預先給藥7 d,第8天采用60Coγ射線全身輻照1次,輻照劑量3.5 Gy,劑量率1.60 Gy/min,造成血虛證模型。輻照后小鼠連續灌胃14 d,于第14天末,目內眥取血1 mL,并室溫靜置3～4 h后以4 500 r/min離心20 min,移取上清液,測定外周血液中白細胞(WBC)、紅細胞(RBC)、血紅蛋白(HGB)數量。摘眼球取血,分離收集血清,采用放射免疫法檢測小鼠血清GM-CSF、IL-3、IL-6、TNF-α的含量。小鼠頸椎脫臼死亡后,快速取出脾臟及胸腺稱重,分別計算與體重的比值。

2　結果

2.1芍藥內酯苷和芍藥苷對體質量和胸腺指數及脾臟指數的影響與空白組比較,模型組體質量顯著低于空白組(P<0.001)。與模型組相比,四物顆粒組的體質量明顯升高(P<0.01);芍藥內酯苷30 mg/kg顯著升高(P<0.001),芍藥苷30 mg/kg組、芍藥內酯苷15 mg/kg和芍藥苷15 mg/kg組體質量明顯升高(P<0.01)。與空白組比較,模型組的胸腺指數顯著降低(P<0.001);與模型組比較,四物顆粒組的胸腺指數顯著升高(P<0.001);芍藥內酯苷30 mg/kg和芍藥苷30 mg/kg組明顯升高胸腺指數(P<0.01),芍藥內酯苷15 mg/kg組、芍藥苷15 mg/kg組升高胸腺指數(P<0.05)。與空白組比較,模型組的脾臟指數降低(P<0.05);與模型組比較,四物顆粒組的脾臟指數升高(P<0.05);各受試給藥組有升高脾臟指數的趨勢差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2芍藥內酯苷和芍藥苷對白細胞數量、紅細胞數量、血紅蛋白數量的影響與空白組比較,模型組的白細胞數量顯著降低(P<0.001);與模型組相比,四物顆粒顯著升高白細胞數量(P<0.001);芍藥內酯苷30 mg/kg和芍藥苷30 mg/kg組明顯升高白細胞數量(P<0.01),芍藥內酯苷15 mg/kg組、芍藥苷15 mg/kg組升高白細胞(P<0.05)。與空白組比較,模型組的紅細胞數量顯著降低(P<0.001);與模型組相比,四物顆粒明顯升高紅細胞數量(P<0.01);芍藥內酯苷30 mg/kg和芍藥苷30 mg/kg組、芍藥內酯苷15 mg/kg組升高紅細胞數量(P<0.05)。與空白組比較,模型組的血紅蛋白數量降低但差異無統計學意義(P>0.05);與模型組比較,四物顆粒有升高血紅蛋白數量的趨勢但差異無統計學意義(P>0.05);各受試給藥組有升高血紅蛋白數的趨勢差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表1　芍藥內酯苷和芍藥苷對放射線輻照所致血虛小鼠的胸腺指數、脾臟指數的影響

注:與空白組相比,▲P<0.05,▲▲P<0.01,▲▲▲P<0.001;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

表2　芍藥內酯苷和芍藥苷對放射線輻照法所致血虛小鼠的WBC、RBC、HGB的影響

注:與空白組相比,▲P<0.05,▲▲P<0.01,▲▲▲P<0.001;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

表3　芍藥內酯苷和芍藥苷對放射線輻照所致

注:與空白組相比,▲P<0.05,▲▲P<0.01,▲▲▲P<0.001;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

2.3芍藥內酯苷和芍藥苷對IL-3、GM-CSF數量的影響與空白組比較,模型組的IL-3的含量顯著降低(P<0.001);與模型組比較,四物顆粒組的IL-3的含量顯著升高(P<0.001);芍藥內酯苷30 mg/kg和芍藥苷30 mg/kg組明顯升高IL-3的含量(P<0.01),芍藥內酯苷15 mg/kg組、芍藥苷15 mg/kg組能升高IL-3的含量(P<0.05)。與空白組比較,模型組的GM-CSF的數量明顯降低(P<0.01);與模型組比較,四物顆粒組的GM-CSF的含量明顯升高(P<0.01);芍藥內酯苷30 mg/kg和芍藥苷30 mg/kg、芍藥內酯苷15 mg/kg組升高GM-CSF的含量(P<0.05),其中芍藥內酯苷30 mg/kg組明顯升高GM-CSF的含量(P<0.01)。見表3。

表4　芍藥內酯苷和芍藥苷對放射線輻照所致

注:與空白組相比,▲P<0.05,▲▲P<0.01,▲▲▲P<0.001;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

2.4芍藥內酯苷和芍藥苷對IL-6、TNF-α數量的影響與空白組比較,模型組的IL-6的含量明顯升高(P<0.01);與模型組比較,四物顆粒組的TNF-α的含量降低差異無統計學意義(P>0.05);芍藥內酯苷30 mg/kg組能降低IL-6的含量(P<0.05),而其他各劑量組有降低IL-6的趨勢但差異無統計學意義(P>0.05)。與空白組比較,模型組TNF-α的含量明顯降低(P<0.01);與模型組比較,四物顆粒組TNF-α的含量明顯降低(P<0.01);芍藥內酯苷30 mg/kg組明顯降低TNF-α的含量(P<0.01),芍藥苷30 mg/kg組能降低TNF-α(P<0.05),其他各劑量組的芍藥內酯苷和芍藥苷對TNF-α的影響不大且差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

3　討論

血虛證是臨床常見病癥,多由大病虧虛、脾胃虛弱、生血無源、失血過多等不同原因引起。放射線輻照法[6]是公認的動物血虛證模型的造模方法之一,輻照能導致造血功能低下甚至衰竭,白細胞從造模后第1天開始就顯著降低,后期紅細胞數量明顯減少,血紅蛋白含量降低,同時引起免疫力低下,從而誘發感染、貧血、出血等并發癥,因此，這種方法模擬的血虛證與臨床患者的血虛狀態相似。高月[7]等通過實驗比較四物湯的治療后發現,3.5 Gy60Coγ射線是制作該輻照模型的最佳劑量。因此,本實驗選擇了用3.5 Gy60Coγ射線全身一次性照射昆明小鼠復制血虛動物模型。我們采用其成方顆粒劑型作為陽性對照藥,并經本實驗室HPLC測定芍藥內酯苷及芍藥苷含量,表明在本實驗給藥劑量下,二者在四物顆粒成方制劑中的用量與本實驗二者的單一成分給藥劑量相當。

實驗結果顯示,芍藥內酯苷與芍藥苷對放射線輻照所致血虛小鼠有明確的補血作用,尤其對白細胞和紅細胞數量的升高作用明顯且與四物顆粒的作用相似,為證實芍藥內酯苷是白芍的特征有效成分提供了進一步的藥理實驗依據[8]。同時二者對胸腺指數的升高作用表明其可刺激血虛狀態下胸腺細胞的增殖,調節免疫功能。據本課題組前期研究顯示[9],芍藥內酯苷和芍藥苷能夠通過機體的免疫調節作用對抗環磷酰胺導致的血虛狀態,是白芍“養血”功效的有效成分。據此,本實驗選用放射線輻照模型進一步從免疫機制及造血細胞因子水平,探討二者補血特點和作用機制。

免疫器官是機體免疫細胞的發源地,造血干/祖細胞在此發育分化為成熟的免疫細胞。放射線輻照法致血虛小鼠的實質為骨髓造血功能的損傷和機體免疫應答的抑制[10]。臨床研究[11]發現人體在貧血狀態時,各種免疫功能均下降,細胞因子的活化,能夠在一定程度闡明保護及修復造血干/祖細胞的機制,而研究芍藥內酯苷和芍藥苷對于不同造血細胞因子的調節作用能揭示二者在補血作用機制上的特點。高月[12]等人研究顯示,芍藥苷可促進骨髓基質細胞分泌造血因子GCSF、GM-CSF、血小板衍生生長因子-α(PDGF-α)等,抑制造血抑制因子巨噬細胞炎性蛋白(MIP)的分泌,從而發揮補血作用。本實驗結果顯示,芍藥內酯苷和芍藥苷作為白芍的2個主要成分都具有明確的補血作用并且均作用于正向造血細胞因子IL-3、GM-CSF,促進多能祖細胞的增殖,而且還能降低TNF-α水平來抑制原始造血干細胞進入細胞周期而發揮保護造血細胞避免輻照損傷的細胞毒作用,從而對抗放射線輻照導致的血虛狀態。這與本課題組前期研究結果相一致。

本課題組研究報道[4-5]芍藥內酯苷是白芍補血作用的特征有效成分。據本實驗結果我們推測,芍藥內酯苷的補血機制可能與其調節多種造血因子有關,其中既有正向因子,也有負向因子,在白芍中與芍藥苷等成分協同作用,從正負2個方面調控血細胞的生成,維持造血功能的穩定。為進一步研究傳統補血藥白芍的特征成分芍藥內酯苷的補血作用及機制,還需從基因及蛋白水平深入進行。

致謝:感謝北京中醫藥大學科研實驗中心李偉老師對本次實驗的大力支持！

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(2016-03-31收稿責任編輯：王明)

Study of Blood Nourishing Effects of Albiflorin and Paeoniflorin on Blood Deficiency Mouse Model Induced by Irradiation of and Effect on Levels of IL-3, GM-CSF, IL-6 and TNF-α

Wang Chenglong, Wang Linyuan, Wang Jingxia, Zhu Yingli, Zhao Danping, Zhang Jianjun

(BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

Objective: To explore the blood nourishing effect and mechanism of Albiflorin and Paeoniflorin on mouse model of blood deficiency syndrome induced by irradiation and its effect on levels of IL-3, GM-CSF, IL-6 and TNF-α. Methods: Mouse model of blood deficiency syndrome was induced by irradiation. Albiflorin and Paeoniflorin were given through gavage. The amount of WBC, RBC, HGB, index of thymus gland and spleen and the levels of GM-CSF, IL-3, IL-6 and TNF-α in serum were detected by radioimmunoassay. Results: Compared with the model group, the amount of WBC and index of thymus gland in the group of 30 mg/kg Albiflorin and 30 mg/kg Paeoniflorin were both increased significantly (P<0.01), and RBC increased in 15 mg/kg Albiflorin and 15 mg/kg Paeoniflorin significantly (P<0.05). The levels of IL-3 in serum in groups of 15 mg/kg Albiflorin, 30 mg/kg Paeoniflorin increased significantly (P<0.05). The levels of GM-CSF in serum in groups of 15 mg/kg Albiflorin, 30 mg/kg Paeoniflorin increased significantly (P<0.05), and the levels of GM-CSF in serum in group of 30 mg/kg Albiflorin increased significantly (P<0.01). The level of TNF-α in serum in groups of 30 mg/kg Paeoniflorin reduced significantly (P<0.05), and the level of TNF-α in serum in group of 30 mg/kg Albiflorin were reduced significantly (P<.001). Conclusion: Albiflorin, as a special compound in Debark Peony Root, which has the same hematopoietic effect as Paeoniflorin. Albiflorin and Paeoniflorin both can nourish blood and yin by cytokines regulation, which is the material basic of Debark Peony Root.

Albiflorin; Paeoniflorin; Irradiation; Blood deficiency syndrome; Cytokines

國家自然科學基金項目(編號:81473370)

王成龍(1988.12—),男,2014級在讀碩士研究生,研究方向:基于中藥基礎理論的藥效機制及物質基礎研究,E-mail:18810900709@163.com

張建軍(1965.08—),女,醫學博士,研究員,博士研究生導師,研究方向:基于中藥基礎理論的藥效機制及物質基礎研究,Tel:(010)64286993,E-mail:zjj59@163.com

R256.2

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.08.050