轉錄因子TBX3在小鼠胚胎動脈囊及弓動脈發育過程中的表達*

許智慧楊艷萍王晶晶宋勵師亮景雅

轉錄因子TBX3在小鼠胚胎動脈囊及弓動脈發育過程中的表達*

許智慧①楊艷萍①王晶晶①宋勵①師亮①景雅①

目的：探討在小鼠胚胎早期發育過程中轉錄因子TBX3（T-box transcription factor3）和動脈囊發育的關系。方法：對胚齡9～12 d（E9～E12）的小鼠胚胎心做連續石蠟切片，抗轉錄因子TBX3抗體、抗胰島因子-1（ISL-1）抗體、抗α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）抗體對切片進行免疫組織化學染色。結果：胚齡9 d，TBX3陽性細胞在呼吸內胚層聚集。胚齡10 d，在動脈囊和第3對弓動脈連接處可見TBX3陽性細胞。胚齡11 d，在第4、6對弓動脈之間可以觀察到TBX3細胞的陽性表達。胚齡12 d，TBX3陽性表達集中于咽前間充質。結論：傳導系的陽性心肌前體細胞TBX3參與動脈囊及弓動脈的形態發生。

動脈囊； 轉錄因子TBX3； 胰島素增強子結合蛋白； 免疫組化；小鼠

First-author's address：Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

動脈囊先后共發出6對弓動脈，從動脈囊發出延伸至背主動脈［1］。6對弓動脈不同時出現，第1、2對弓動脈很早消失退化，第5對發育不全并退化，在小鼠胚胎時期筆者主要觀察第3、4、6對弓動脈的形成。動脈囊位于流出道遠端，流出道的形態發生與動脈囊的分隔緊密關聯。T-box所含有的轉錄因子調控胚胎發育的多個方面，包括心臟的形態發生和模式，人類和小鼠缺失或者突變一定數量的T-box基因會導致先天性心臟缺陷，小鼠心臟TBX3的表達最先在心臟循環開始的流出道被發現［2-3］。其表達可以描述發育中的心臟傳導系統、房室管心內膜墊和流出道間質，發育中的心臟轉錄因子TBX3主要表達在中樞傳導系的心肌前體細胞［4-6］。TBX3表達缺失會導致心臟畸形，包括房室管細胞的過度增殖，心室不完全分隔，右心室雙流出道和主動脈弓形成延遲［7］。TBX3基因敲除突變的小鼠除導致中樞傳導系工作心肌異位表達、心室或心房形成異位節律點外，還會引起小鼠流出道出現嚴重畸形，包括主動脈弓和主肺動脈干的異常［8-9］。在以往的報道中多見第二生心區ISL-1陽性咽前間充質細胞和α-SMA陽性細胞對動脈囊的分隔［10-11］。對TBX3在第二生心區的時空表達雖有描述但與弓動脈的形成關系報道卻較少。本實驗用α-平滑肌肌動蛋白抗體（α-SMA）標記發育中心肌及平滑肌，用ISL-1抗體標記心肌前體細胞，TBX3抗體顯示轉錄因子TBX3表達和動脈囊、弓動脈發育的關系。免疫組織化學方法觀察3種蛋白質在E9～12小鼠胚胎第二生心區的時空表達特征，以探討其在動脈囊發育過程中的可能作用，為先天性弓動脈發育畸形提供實驗依據。

1　材料與方法

1.1材料 取足3月齡健康雌性昆明鼠30只，體重22～28 g，在明暗相間12 h條件下飼喂，動情期與同種雄鼠于19∶00 合籠，次早晨發現陰栓者為妊娠0.5 d。乙醚麻醉處理妊娠小鼠收集胚胎，胚齡9 d（E9）胚胎帶子宮固定，其余胚胎子宮內剝離出后固定。標本固定脫水詳見文獻［12］，石蠟包埋。各胚齡胚胎分別取7只，行7 μm厚連續切片，每4片取1片做HE染色以便觀察胚胎形態學特征，其余心臟切片用于免疫組織化學染色，多聚賴氨酸處理載玻片。

1.2方法 免疫組織化學染色PAP法染色，標本脫蠟水化后，3%過氧化氫、TENG-T（Tris 10 mmol/L，EDTA 5 mmol/L，NaCl 150 mmol/L，0.25% gelatin，0.05% Tween-20，pH 8.0）依次各處理40 min，以減低內源性過氧化物酶活性和非特異性背景染色。處理后的切片分別用小鼠抗α-SMA單克隆抗體（1∶800，武漢博士德生物工程有限公司），兔抗ISL-l多克隆抗體（1∶120，Abcam公司），山羊抗TBX3多克隆抗體（1∶150，Santa Cruz公司）室溫下過夜孵育。根據所孵育一抗的不同，滴加相對應的二抗和三抗，時間均為2 h，兔過氧化物酶-抗過氧化物酶復合物孵育1.5 h；DAB顯色，出現呈棕黃色的陽性結果時滴加蒸餾水終止。常規脫水、透明、中性樹膠封片，抗體用PBS（pH 7.4）稀釋。

2　結果

（1）胚齡9 d，呼吸內胚層ISL-1和TBX3細胞陽性表達并在此聚集，流出道呈管狀，在流出道的遠段ISL-1陽性細胞向近段延伸并逐漸表達α-SMA，見圖1A～C。（2）胚齡10 d，流出道進一步增長，陽性α-SMA細胞延伸至心包腔的背側壁與臟壁中胚層返折處，見圖2C。咽內胚層中ISL-1陽性細胞數量增多，鰓弓核心間充質ISL-1陽性細胞增殖添加到動脈囊和第3對弓動脈連接處，見圖2A）。咽兩側TBX3細胞呈現強陽性表達，在動脈囊和第3對弓動脈相交接處出現TBX3和ISL-1陽性細胞，見圖2A、2B～2E。（3）胚齡11d，α-SMA由流出道延伸至整個動脈囊壁，見圖3C。ISL-1陽性咽前間充質細胞圍繞呼吸內胚層形成對稱的特征性錐體形結構，經動脈囊背側壁伸入動脈囊腔，形成主肺動脈隔原基（圖3A），在該椎體結構有TBX3陽性細胞表達（圖3B）［13］。隨著第二生心區間充質細胞數目的增加，TBX3陽性細胞在咽前間充質中明顯增多（圖3E），ISL-1陽性細胞不斷的增殖添加到錐體結構，錐體結構縱向延長（圖3D），動脈囊腹側壁向腔內橫向突起，兩者共同將動脈囊分隔，形成第4、6對弓動脈；在第4、6對弓動脈之間未見ISL-1陽性細胞（圖3D），但可見明顯的TBX3陽性細胞（圖3E、3G）。（4）胚齡12 d，流出道縮短，動脈囊分隔為升主動脈及肺動脈干，流出道遠端α-SMA表達止于大動脈根部見圖4A～4C（da：背主動脈；ph：咽；as：動脈囊；o：流出道；3：第3對弓動脈；fg：前腸；4：第4對弓動脈；6：第6對弓動脈；d：流出道遠段；a：升主動脈；pt：肺動脈干；aps：主肺動脈隔）。

圖1　胚齡9 d心橫切面注：1A示ISL-1陽性表達，1B示TBX3陽性表達，1C示α-SMA陽性表達，↑流出道遠段α-SMA陽性表達，標尺示200 μm。

圖2　胚齡10 d心橫切面注：2A示ISL-1陽性表達，↑示動脈囊和第3對弓動脈連接處；2B示TBX3陽性表達，↑示動脈囊和第3對弓動脈連接處；2C示陽性α-SMA細胞延伸至心包腔的背側壁與臟壁中胚層返折處；2D、2E分別是2A、2B的放大，2A、2B標尺示200μm，2C標尺示500μm，2D、2E標尺示100μm。

圖3　胚齡11 d心橫切面注：3A、3B分別示ISL-1、TBX3陽性表達，↑示ISL-1陽性咽前間充質細胞圍繞呼吸內胚層形成對稱的特征性錐體形結構；3C示α-SMA陽性表達；3D示ISL-1陽性表達，↑示主肺動脈隔；3E示TBX3陽性表達`，↑示第4、6弓動脈間；3G為E的放大，3A～F標尺示200μm；3G標尺示100μm

圖4　胚齡12 d心橫切面注：3A示ISL-1陽性表達，3B示TBX3陽性表達，3C示α-SMA陽性表達，標尺示500μm

3　討論

22q11.2染色體缺失綜合征（22q11.2DS），其特征為咽管和心臟發育異常；而在22q11.2DS經常觀察到的是心血管畸形，其中最為常見的是流出道畸形，流出道的發育和分隔缺陷會造成圓錐動脈干和室間隔先天性心臟畸形［9］。編碼基因的T-box轉錄因子與22q11.2DS密切相關，T-box家族成員TBX2 和TBX3是調節流出道發育和咽的發生所必須［14］。相關研究表明，TBX3基因突變在人類導致尺骨-乳腺綜合征［15-16］。TBX3基因敲除的小鼠，會引起小鼠流出道出現嚴重畸形，包括主動脈弓和肺動脈干的異常［9］。流出道的遠端與動脈囊相延續，在胚胎心臟早期流出道分隔開始于動脈囊。在咽前間質中表達的TBX3陽性細胞和心臟神經嵴細胞共同填充流出道并參與流出道的分隔［17］。呼吸內胚層向腹側的延伸可對流出道正常分隔，以及誘導ISL-1陽性細胞正常遷移［18］。轉錄因子ISL-1是第二生心區心前體細胞良好的標記蛋白，ISL-1基因敲除小鼠胚胎心流出道、右心室及大部分心房組織缺失，胚胎死于10.5 d［19］。因此以ISL-1的遷移做參照，觀察TBX3的表達可以進一步說明其對動脈囊的作用。

本實驗觀察到，胚齡9 d時TBX3的陽性表達主要集中在呼吸內胚層上，同時在該區域有ISL-1的陽性表達，筆者已知ISL-1和多種細胞信號及轉錄因子相互作用調控第二生心區的發育、增生和細胞特異性的保持［19-20］。并有數據表明，TBX3可能間接控制流出道發育，通過細胞間信號傳導途徑協調第二生心區的增殖和分布［9］。呼吸內胚層細胞的數目會隨著胚胎心臟發育不斷增殖并對流出道分隔，提示TBX3陽性細胞一定時間內在呼吸內胚層會與ISL-1陽性細胞同步表達。

胚齡10～11 d時，呼吸內胚層TBX3的陽性細胞數目增多，同時咽兩側鰓弓出現TBX3陽性細胞。鰓弓核心間充質細胞向動脈囊腔增殖，在動脈囊與第3對弓動脈的連接處可以觀察到TBX3的陽性細胞。由于ISL-1陽性細胞在動脈囊腔構成的錐體結構向下延伸，動脈囊被進一步分隔；分隔后的動脈囊形成第4、6對弓動脈，兩者之間可明顯觀察到有TBX3陽性細胞。研究報道用在動脈內皮細胞表達的等位基因Cx40-eGFP標記弓動脈連接處的TBX3-/-，在流出道與第3、4對弓動脈連接的地方可見其表達，胚胎中異常的弓動脈可以觀察到TBX3的一個子集［9，21-22］。TBX3的缺失除會延遲弓動脈的形成，還會影響已知調節流出道伸長的其他信號傳導途徑，如：骨形態發生蛋白（BMP）信號促進第二生心區動脈極的發生和BMP4在流出道遠端表達都被降低，從而進一步影響流出道的形態發生［9］。結果提示，除ISL-1間充質細胞對動脈囊的分隔外，TBX3也參與動脈囊及弓動脈的形態發生。

胚齡12 d時，升主動脈及肺動脈干壁內可見ISL-1陽性間充細胞，腔內可見α-SMA陽性表達，主肺動脈隔以及升主動脈和肺動脈干開始向平滑肌分化，由此筆者可知TBX3對動脈囊及弓動脈的影響主要在早期胚胎發育過程。結合上述的研究和本實驗的結果，可為動脈囊及弓動脈的發生提供進一步的形態學依據。

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Expression of the Transcription Factor TBX3 during Development of Mouse Embryonic Aortic Sac and Arch Arteries

XU Zhi-hui，Y ANG Y an-ping，WANG J ing-jing，et al.

Medical Innovation of China，2016，13（19）：014-017

Objective：To explore the relationship between transcription factor TBX3（ T-box transcription factor3） and the development of aortic sac in the during early development mouse embryo.Method：Serial paraffin sections of mouse embryonic hearts form embryonic 9 days to 12 days（E9-E12） were stained with antibodies against T-box transcription factor3（TBX3），islet-1（ISL-1） and α-smooth muscle actin（ α-SMA ）by the immunohistochemical method.Result：At embryonic 9 days，TBX3 positive cells gathered in the pulmonary endoderm.At embryonic 10 days，we could observe that there TBX3 positive cells at the communication between aortic sac and third arch artery.At embryonic 11 days，communication between the fourth and sixth arch arteries observed TBX3 positive expression.At embryonic 12 days，TBX3 positive expression was mainly focused on pharyngeal mesenchymal.Conclusion：The cardiac conduction system of positive precursor cells TBX3 involved in aortic sac and arch arteries morphogenesis.

Aortic sac； Transcription factor TBX3； Islet-1； Immunohistochemistry； Mouse

10.3969/j.issn.1674-4985.2016.19.004

國家自然科學基金資助項目（3077114l，31200899）

①山西醫科大學 山西 太原 030001

景雅

2016-04-29） （本文編輯：周亞杰）