電針治療對缺氧缺血性腦病模型大鼠mTOR表達的影響

徐濤，王翠霞，王一冰，劉偉，張輝

（1.青島市婦女兒童醫院，山東青島　266034；2.青島市第八人民醫院，山東青島　266041；3.青島市中心醫院，山東青島　266031；4.青島大學醫學院中西醫結合中心，山東青島　266021）

電針治療對缺氧缺血性腦病模型大鼠mTOR表達的影響

徐濤1，王翠霞2，王一冰1，劉偉3，張輝4

（1.青島市婦女兒童醫院，山東青島266034；2.青島市第八人民醫院，山東青島266041；3.青島市中心醫院，山東青島266031；4.青島大學醫學院中西醫結合中心，山東青島266021）

【目的】觀察電針對缺氧缺血性腦病模型大鼠雷帕霉素靶蛋白（mTOR）表達的干預作用。【方法】選擇7日齡SD大鼠，隨機分為3組：假手術組、模型組、電針組。每組又以1、3、7、21 d分為4個亞組，采用蘇木精—伊紅（HE）染色觀察缺氧缺血側腦組織的形態學變化，Western blot法檢測mTOR的蛋白表達。【結果】HE染色顯示：電針組在21 d時，神經細胞界限清楚，排列有序，細胞腫脹變輕，細胞輪廓及核仁清晰，可見膠質細胞增生。模型組mTOR蛋白的表達均在第1天開始增加，第3、7、21天持續增加，與假手術組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。電針組在1、3、7、21 d 4個時間點與模型組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。【結論】電針能夠促進mTOR蛋白水平的表達，對缺氧缺血性腦損傷大鼠可起到腦保護作用。

缺氧缺血性腦病/針灸療法；雷帕霉素靶蛋白；腦皮質/病理學；疾病模型，動物；大鼠

新生兒缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）是各種原因引起的缺氧和腦組織血流減少，腦組織表現為水腫、軟化、壞死、出血等主要改變，是新生兒窒息引起的重要并發癥之一，是兒童神經系統傷殘的常見原因之一［1］。目前研究表明：新生兒缺氧缺血腦損傷發生后，短時間內神經元細胞自噬明顯上調［2］，而自噬過程與雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路關系密切。mTOR是許多細胞內重要的信號傳導通路，它能夠直接參與調節蛋白合成、基因轉錄、自噬等，并影響著神經干細胞的分裂、神經環路的形成、神經可塑性等［3］。mTOR活化后可抑制自噬的發生，起到腦保護的作用［4］。

近年來，電針在治療缺氧缺血性腦損傷中的療效越來越受到肯定，已有文獻［5］報道，電針治療可以促進缺血部位腦組織的修復與再生。因此，本研究通過觀察mTOR的表達，探討在分子水平上，電針對缺氧缺血性腦病模型幼鼠的腦保護作用，為缺氧缺血性腦病的針灸治療提供科學依據，現報道如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物與分組

SPF級7日齡SD大鼠母帶子共14窩，每窩9只或10只，共136只，雌雄不拘，母乳喂養，體質量10.5～15.0 g，購自青島市藥檢所，合格證號：scxk魯20130001。各組的喂養條件相同，動物房溫度控制在20℃～25℃，光暗周期各12 h。按照隨機區組法分為3組，分別于術后第1天、第3天、第7天和第21天4個時間點取腦并檢測各項指標。

1.2主要試劑

1.3主要儀器

DW-40W100-20℃低溫冰箱為海爾公司產品；705型 -80℃ Thermo超低溫冰箱為美國Harris公司產品；AMA440 ASTELL高壓滅菌鍋為英國產品；SIM-F140AY65制冰機為日本SANYO產品；KA-1000低速離心機為上海安亭科學儀器廠產品；165-1801 Bio-Rad電泳儀為美國伯樂公司產品；Gel Doc XR+凝膠成像分析儀為美國伯樂公司產品；THZ-82A水浴恒溫振蕩器為浙江金壇華城開元實驗儀器廠產品；FA電子天平為上海方瑞儀器有限公司產品；101A-2型干燥箱為上海試驗儀器總廠產品；G6805-II電針儀為上海華誼廠產品。

1.4模型制作

假手術組25只，乙醚麻醉，切開頸部皮膚，分離雙側頸總動脈，但不結扎，縫合切口后不作低氧處理，4 h后行為學測定均無異常。將剩余111只幼鼠麻醉，仰臥固定，模型采用Rice等［6］的方法并加以改進，結扎雙側頸總動脈，置于自制密閉容器中，置于37℃恒溫水浴箱中，以1 L/min的速度通入低氧混合氣體（體積分數8%氧氣，92%氮氣），復制缺氧缺血性腦病的幼鼠模型。缺氧2.5 h后取出幼鼠，將存活者保溫1 h后放回鼠籠。將成功的動物模型共76只納入統計范圍，按照隨機區組法分為模型組、電針組2組。手術2 h后仍未蘇醒或已死亡的大鼠剔除不用。

1.5電針干預

假手術組僅手術分離但不結扎雙側頸總動脈，切口縫合后亦無需做低氧處理；模型組分離并結扎雙側頸總動脈，縫合切口，不做其他處理；電針組缺血缺氧后第2天開始，以0.5寸毫針向后平刺百會穴5 mm：位置在顱頂正中；直刺大椎穴5 mm：位置在背部正中第7頸椎與第1胸椎間；直刺兩側曲池穴8 mm：位置在肘橫紋的外端和肱骨外上髁之間連線中點；速刺涌泉穴3次：位置在足底前三分之一。百會穴、曲池穴采用G6805-II電針治療儀進行電針刺激，疏密波，5～10 Hz，以穴周組織輕微抖動為度，電壓約3～5 V，每日1次，每次時間10 min；其定位參照大鼠的常用針灸穴位［7］。

1.6病理檢查

3組大鼠分別在術后第l、3、7、21天4個不同時間點進行取材。經過視交叉處冠狀向后切，取缺氧缺血側大鼠腦組織約2 mm，以40 g/L多聚甲醛緩沖液固定，石蠟包埋，制備成4 μm厚度的切片，顯微鏡下觀察腦組織病理改變。

1.7Western blot印跡法檢測

提取腦組織總蛋白，制備十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠，電泳分離，采用全濕法轉膜，取出聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜），放入50 g/L脫脂牛奶中封閉過夜。孵育1 h后加入抗 mTOR單克隆抗體一抗，孵育3 h，漂洗，加入羊抗兔二抗，孵育1 h，再經磷酸鹽緩沖液（PBST）洗滌后，浸洗5 min，共3次后顯影。將膜置于A、B混合顯影液中，采用凝膠成像系統掃描，Quantity One軟件進行灰度分析。以GAPDH的灰度值作為內參，按公式計算：目的蛋白相對值（relative value of protein，RVP）=（樣品灰度值/GAPDH灰度值），用以上步驟重復測定3次，取平均值作為該樣本的最終值，進行統計分析。

1.8統計方法實驗結果采用SPSS 17.0統計軟件分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組比較經方差齊性檢驗后，采用多組間單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組病理檢查

圖1結果顯示：假手術組神經細胞排列整齊緊密，結構正常，胞漿呈淡紅色，胞核呈藍色，核仁清晰。模型組第1天時，即出現神經細胞改變，呈篩網狀結構，有變性壞死，壞死細胞呈三角形和多角形固縮，細胞間隙增大，細胞質染色欠規則，神經細胞胞質濃縮、深染，胞漿有空泡形成，細胞核固縮深染，核仁消失；第3天時神經細胞變性壞死較前更明顯，著色深，細胞間排列紊亂，常見細胞核細胞膜破裂，正常細胞結構消失，仍可見大量細胞核固縮、深染、裂解；第7天及21天，出現大量神經細胞丟失，伴有少量固縮核，周圍有較多膠質細胞增生及空泡形成。電針組第1天即出現大量神經細胞壞死性改變，細胞核固縮，神經細胞胞質濃縮、深染；第3天可見神經細胞腫脹變性，但壞死的程度較模型組輕；第7天時神經細胞界限清楚，排列較前有序，只出現少量增生的膠質細胞；第21天時神經細胞界限清楚，細胞腫脹變輕，細胞間排列有序，可見膠質細胞增生，神經細胞輪廓及核仁仍清晰。

上述表現以缺血缺氧后第3天神經細胞變性壞死最為明顯。而且，隨著缺血時間的延長，上述各組的病理改變有減輕趨勢，而電針組與模型組比較，神經細胞形態恢復較好，細胞輪廓和核仁清晰，表明電針刺激對缺血缺氧導致的神經元損傷具有一定的保護作用。

2.2各組不同時段腦組織中mTOR蛋白表達變化

表1結果顯示：模型組mTOR蛋白的表達均在1 d時開始增加，3 d、7 d、21 d持續增加，與假手術組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。在1 d、3 d、7 d、21 d 4個時點，電針組均較模型組進一步升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

圖1　各組大鼠皮質區病理形態比較（HE染色，×400）Figure 1　Histological features of rat cortex of different groups（by HE staining，×400）

表1　幼鼠缺氧缺血側腦組織mTOR蛋白表達Table 1　Comparison of cerebral mTOR expression in rats of different groups　（±s，pmTOR/GAPDH）

表1　幼鼠缺氧缺血側腦組織mTOR蛋白表達Table 1　Comparison of cerebral mTOR expression in rats of different groups　（±s，pmTOR/GAPDH）

①P＜0.05，與假手術組比較；②P＜0.05，與模型組比較

時間假手術組模型組電針組N 6 6 6 t=1 d 1.006 1±0.135 8 1.341 1±0.043 2①1.750 2±0.131 5②t=3 d 1.006 1±0.135 8 2.131 0±0.243 5①2.832 3±0.073 2②t=7 d 1.042 8±0.337 9 2.585 8±0.162 1①3.232 4±0.104 9②t=21 d 1.029 1±0.209 8 2.684 9±0.148 7①3.534 1±0.134 8②

3　討論

mTOR是一個259 kDa的高度保守絲氨酸/蘇氨酸激酶，是磷脂酰肌醇激酶相關蛋白激酶（phosphatidylinositol kinase-related kinase，PIKK）的家族成員，在各種真核細胞中廣泛表達。mTOR在進化上相對保守，可整合營養、能量及生長因子等多種細胞外信號，參與基因轉錄、蛋白質翻譯、核糖體合成等生物過程，在細胞生長和凋亡中發揮極為重要的作用［8-9］。近年來，mTOR的生物學功能研究日益深入，特別是其與細胞凋亡及自噬、蛋白質合成、免疫、細胞運動及代謝等的聯系越來越受到重視［10］。mTOR與神經干細胞、神經回路和神經可塑性的關系密切［11-12］。

mTOR在多種神經系統疾病發生發展的過程中發揮著重要作用。最新研究發現，mTOR是一種有效的自噬調節劑，細胞自噬是真核生物中相對保守的一種亞細胞代謝途徑，是細胞在多種不利因素作用下的一種適應性反應，能為細胞代謝提供循環可利用的原料及能量，維持細胞穩定，促進細胞生存［13］。在營養充足的條件下，自噬處于較低水平，僅在胞質中去除受損和多余的細胞器以維持細胞內環境穩定，稱為基本自噬。當某些條件發生改變，如缺氧、能量發生變化、缺血、寒冷、營養物質缺乏等情況下，機體可通過多種信號途徑激活自噬，這種稱為誘導型自噬。在這種情況下，細胞自噬被過度激活，又會導致細胞程序性死亡，即II型程序性細胞凋亡，從而引起一系列疾病過程［14］。在自噬的活性調節中，其分子誘導機制非常復雜且高度保守，mTOR通路及其相關因子在誘導細胞自噬的發生方面發揮了最直接的調控作用，是調節自噬信號途徑的關鍵分子。當某些病理狀態造成機體自噬水平過高時，生物體便會通過一系列復雜的途徑，上調mTOR蛋白的表達，mTOR的激活可通過調控自噬相關基因，直接抑制自噬的啟動，從而阻斷細胞凋亡，對生物體起到保護作用［15］。

本研究結果顯示：模型組幼鼠腦組織中mTOR蛋白的表達均在缺氧缺血后第1天開始增加，至第7天時上升趨勢較前明顯，但在第7天至第21天時上升趨勢不明顯，提示在腦缺氧缺血產生后，幼鼠神經系統可通過磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶（PI3-K/Akt）途徑自發產生腦保護作用，但在無其他干預措施時，幼鼠自發產生的腦保護能力僅能維持一個較短的時段。電針組中，mTOR的變化自第1天起呈上升趨勢，并能維持持續上升；第3天、7天、21天與模型組比較，差異均有統計學意義。綜上所述，電針能促進損傷腦組織中mTOR蛋白的表達，對缺氧缺血性腦損傷大鼠具有較好的腦保護作用。本結果可為新生兒缺氧缺血性腦病的治療提供思路。

mTOR信號通路普遍存在于生物體內，與細胞生命活動息息相關，并與臨床各種疾病有廣泛的聯系。但mTOR的腦保護作用具體通過何種機制作用于生物體，mTOR與其他調控因子之間的作用關系如何，電針是否通過其他更多信號通路達到神經保護作用等問題，有待進一步深入研究。

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【責任編輯：黃玲】

Effect of Electro-acupuncture on Mammalian Target of Rapamycin Expression in Hypoxic-ischemic Encephalopathy Newborn Rats

XU Tao1，WANG Cuixia2，WANG Yibing1，LIU Wei3，ZHANG Hui4
（1.Qingdao Women and Children Hospital，Qingdao 266034 Shandong，China；2.The Eighth People's Hospital of Qingdao，Qingdao 266041 Shandong，China；3.Qingdao Central Hospital，Qingdao 266031 Shandong，China；4.Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Center，Medical School of Qingdao University，Qingdao 266021 Shandong，China）

ObjectiveTo observe the intervention effect of electro-acupuncture（EA）on mammalian target of rapamycin（mTOR）expression in hypoxic-ischemic encephalopathy（HIE）newborn rats.Methods Seven-day-old SD rats were randomly assigned into 3 groups，namely sham-surgery group，HIE model group，and EA group. All of the groups were subdivided into 4 subgroups in terms of 4 time periods of 1，3，7 and 21 day（s）. Hematoxylin-eosin staining was used for the observation of histological changes in the affected cerebral region. Expression levels of cerebral mTOR were detected with Western blotting method.Results The results of HE staining showed that EA group at experimental day 21 had clear organizational structure，ordered arrangement of neurons，relieved cellular swelling，well cell integrity with clear nucleolus and proliferative glial cells. Compared with the sham-surgery group，mTOR level of the model group was dramatically increased on the 1st，3rd，7th and 21st day（P＜0.05），and the mTOR expression level of EA group was significantly higher than that in the model group at the above time points（P＜0.05）.Conclusion EA can promote mTOR expression in brain tissue and can protect the brain of newborn rats from HIE.

hypoxic-ischemic encephalopathy/acup-moxibustion therapy；mammalian target of rapamycin；cerebral cortex/pathology；disease models，animal；rats

R259；R746.2

A

1007-3213（2016）05-0669-05

10.13359/j.cnki.gzxbtcm.2016.05.013

2016-03-24

徐濤（1973-），女，副研究員，副主任醫師，碩士研究生導師；E-mail:307040527@qq.com

王翠霞，女，主治醫師；E-mail:qdcxw@163.com

國家自然科學基金資助項目（編號:81202761）