骨碎補總黃酮對牽張成骨過程中骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2和轉(zhuǎn)化生長因子-β1表達的影響

高怡加，黃培鎮(zhèn)，李悅，姜自偉，楊冰，黃楓，陳基長

（1.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院骨科，廣東廣州　510405；2.廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院　廣東廣州　510405）

骨碎補總黃酮對牽張成骨過程中骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2和轉(zhuǎn)化生長因子-β1表達的影響

高怡加1，黃培鎮(zhèn)1，李悅1，姜自偉1，楊冰2，黃楓1，陳基長1

（1.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院骨科，廣東廣州510405；2.廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院廣東廣州510405）

【目的】探討骨碎補總黃酮對家兔股骨牽張成骨的影響。【方法】選用健康家兔32只，隨機分為治療組和對照組，每組16只。行單側(cè)股骨牽張術(shù)，以自制延長器固定。經(jīng)7 d延遲期，以1 mm/d的速度牽張，2次/d，連續(xù)10 d。治療組動物自術(shù)后第1天用骨碎補總黃酮溶液灌胃，至實驗結(jié)束。固定28 d后處死動物，留取標本，行組織學觀察及免疫組織化學檢測。【結(jié)果】治療組新生骨組織成熟骨質(zhì)區(qū)域增大，成骨細胞數(shù)、骨小梁面積百分比均顯著高于對照組，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 （BMP-2）和轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）呈棕色深染，染色程度顯著高于對照組。【結(jié)論】骨碎補總黃酮能有效地加速骨牽張中新生骨質(zhì)的生成與成熟。

牽張成骨；骨碎補總黃酮；BMP-2；TGF-β1

目前，牽張成骨（distraction osteogenesis，DO）技術(shù)在臨床被廣泛應(yīng)用于骨髓炎、骨肉瘤、各種先后天骨畸形等疾病的治療，但存在固定時間長的弊端。尋找一種有效、安全的方法，縮短牽張成骨固定時間，一直是骨科工作者努力的方向。近年來，對內(nèi)源性骨生長因子在牽張成骨過程中的表達和意義，以及將外源性骨生長因子植入促進牽張延長過程中新骨形成成為研究熱點。研究雖取得了一定成績，但離應(yīng)用于臨床尚有很大差距，甚至可能存在抑制成骨的反作用。祖國醫(yī)學在促進新骨形成、骨折愈合方面積累了大量經(jīng)驗。研究表明，骨碎補總黃酮可加速成骨細胞分化和增殖，促進骨基質(zhì)形成和鈣鹽沉積，提高骨修復中骨質(zhì)形成和成熟的速度［1］。本研究應(yīng)用組織學、免疫組織化學等方法，初步探討骨碎補總黃酮對家兔股骨牽張成骨新骨形成過程中骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）和轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）的影響，為中醫(yī)中藥在牽張成骨領(lǐng)域的應(yīng)用提供實驗依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物選用清潔級健康成年新西蘭兔，購自廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心，許可證號：SCXK（粵）2008-0002，動物質(zhì)量合格證號：No. 44007200006322，32只，雌雄不限，體質(zhì)量2.5～3.0 kg。

1.2實驗藥物骨碎補總黃酮由北京歧黃制藥有限公司提供，國藥準字H20030007，批號：130925，每粒膠囊0.25 g，含有效成份0.18 g。

1.3主要儀器和試劑采用自行設(shè)計的組合式單邊家兔股骨牽張器。5804R高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；TP1020半自動臺式組織脫水機、Leica AutoStainer XL自動染色機（德國Leica biosystems公司）；KD-BM生物組織包埋機、KD-202石蠟切片機（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司），BX 53生物顯微鏡（日本Olympus公司）。兔BMP-2、TGF-β1免疫組織化學試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司）。

1.4動物模型制備術(shù)前24 h禁食、水，肌注利眠寧（0.1 mL/kg）全身麻醉，常規(guī)備皮消毒，分別在股骨外側(cè)皮膚做一長約4 cm縱行切口，顯露股骨，在股骨中段截骨，在骨折遠近兩端各安放自制牽張器，置入克氏針牢固固定，最后逐層縫合。間歇期為7 d，后每天以1 mm/d的速率牽引，共牽引10 d，之后固定28 d。

1.5動物分組與給藥將實驗動物隨機分為治療組和對照組，每組16只。治療組動物自術(shù)后第1天，根據(jù)人和動物體表面積換算，每日給予劑量0.108 g·kg-1·d-1灌胃；試驗過程中每2周稱體質(zhì)量1次，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整給藥量。對照組用等體積生理鹽水灌胃。術(shù)后3 d每天腹腔注射0.1 mL青霉素（2.4×105mg/L）。

1.6標本采集、觀察與處理牽張固定完成后處死實驗動物，截取股骨牽張區(qū)骨痂生長部位及其兩端正常骨組織為標本，去除軟組織。觀察標本牽張區(qū)股骨的外觀形態(tài)、牽張器固位情況和牽張區(qū)成骨情況。

1.7標本切片制作分切標本，一部分標本置于10%（體積分數(shù)，下同）的中性甲醛溶液中，另一部分置于4%多聚甲醛（含0.1%焦炭酸二乙酯）溶液中，固定24 h，然后用乙二胺四乙酸脫鈣，乙醇逐級脫水，石蠟包埋，制作石蠟切片。

1.8組織學檢查切片經(jīng)蘇木精—伊紅（HE）染色，光學顯微鏡下放大200倍后觀察骨組織學表現(xiàn)。

1.9免疫組織化學SP法染色與分析將切片標本用免疫組織化學SP法，檢測股骨牽張區(qū)骨組織中BMP-2和TGF-β1的表達。采用Tavkli評分系統(tǒng)［1］對染色結(jié)果進行觀察分析，對骨生長因子在牽張成骨骨痂中的表達進行半定量分析。“+++”、“++”、“+”分別代表免疫組織染色的強、中、弱，“+/-”代表不確定或極微陽性染色，“-”代表染色為陰性。

1.10統(tǒng)計方法采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，2組間比較采用Fisher確切概率法，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1大體標本觀察圖1結(jié)果顯示：治療組標本牽張間隙處骨膜厚度與正常骨膜相當，骨膜與牽張間隙內(nèi)骨痂結(jié)合緊密，新生骨組織填充牽張間隙充分，具有一定的機械強度，骨斷端已連接。

2.22組骨組織學表現(xiàn)圖2結(jié)果顯示：與對照組比較，治療組骨組織形成過渡區(qū)范圍擴大明顯，纖維組織區(qū)明顯減少或消失，軟骨區(qū)少；針狀骨小梁出現(xiàn)在少量纖維組織帶內(nèi)，成骨細胞沿類骨質(zhì)邊緣排列密集；骨質(zhì)形成過渡區(qū)，新生骨小梁數(shù)目增多、寬度增大，邊緣有成骨細胞密集排列，骨小梁間距減小，成骨細胞于骨小梁周圍整齊排列；靠近截骨線處骨成熟區(qū)范圍增加。

圖1　治療組家兔固定28 d股骨的大體形態(tài)Figure 1　Macroscopic features of rabbit femur in the treatment group after 28-day fixation

圖2　2組家兔固定28 d骨組織學觀察（HE染色，×200）Figure 2　Histologicfeaturesofrabbitbonetissue in the two groups after 28-day fixation（by HE staining，×200）

2.32組免疫組織化學結(jié)果從免疫組織化學S-P法染色結(jié)果可見BMP-2和TGF-β1在細胞胞漿中呈棕黃色。對這2種骨生長因子在牽張骨痂中的表達進行半定量分析后，結(jié)果顯示：治療組BMP-2、TGF-β1染色陽性率均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1、表2。

表1　2組BMP-2染色程度比較Table 1　Comparison of BMP-2 staining degrees in the two groups

表2　2組TGF-β1染色程度比較Table 2　Comparison of TGF-β1 staining degrees in the two groups

圖3、圖4結(jié)果顯示：固定28 d后，治療組股骨牽張區(qū)組織BMP-2和TGF-β1深染程度顯著高于對照組，表明治療組中相關(guān)目的蛋白的含量高于對照組。

圖3　2組家兔固定28 d股骨牽張區(qū)組織BMP-2表達比較（免疫組織化學法，×200）Figure 3　Comparison of BMP-2 expression in rabbit femur distraction area of the two groups for 28-day fixation （by immunohistochemical method，×200）

圖4　2組家兔固定28 d股骨牽張區(qū)骨組織TGF-β1表達比較（免疫組織化學法，×200）Figure 4　Comparison of TGF-β1 expression in rabbit femur distraction area of the two groups for 28-day fixation （by immunohistochemical method，×200）

3　討論

長骨干骨缺損一直是臨床治療的難題，其形成原因主要有嚴重開放性粉碎骨折、骨不連、骨折術(shù)后感染、慢性骨髓炎大塊死骨切除或腫瘤長段骨切除等。傳統(tǒng)游離松質(zhì)骨植骨修復后，即使覆蓋的軟組織血運良好，也常會有不同程度的骨吸收，對于超過4～6 cm的長段骨缺損存在較大的應(yīng)用局限；帶血運的骨移植雖愈合較快，但對顯微技術(shù)要求過高，且存在損傷大、出血多、移植骨較細、再骨折風險高等不足，難以推廣［2］。牽張成骨技術(shù)基于牽張成骨原理，配合日益發(fā)展的外支架技術(shù)，可有效治療骨不連與骨缺損，也可矯正各種原因?qū)е碌闹w畸形。牽張成骨技術(shù)的有效應(yīng)用使骨髓炎及骨腫瘤治療中大段截骨也得到了很好的解決，治療效果取得了飛躍式的提高。此外，對骨缺損患者而言，應(yīng)用牽張成骨技術(shù)使患者避免了骨移植供區(qū)的痛苦及相關(guān)風險。所以，牽張成骨技術(shù)在骨缺損的治療中發(fā)揮著越來越重要的作用［3］。但牽張成骨在臨床上也存在一些不足之處尚待解決，如固定時間長，總的治療時間也相應(yīng)較長等。多年來，研究者們進行了大量臨床和實驗研究，應(yīng)用多種方法加速成骨，以縮短治療周期。

Kim等［4］發(fā)現(xiàn)將重組外源性生長因子BMP-2作用于兔脛骨牽開區(qū)，能起到促進成骨的作用。但是，外源性BMP-2的最佳使用劑量尚不明確，使用效果也不確切；BMP-2局部應(yīng)用時容易因彌散、稀釋或丟失而需反復使用，導致費用增加。何時導入外源性BMP-2、BMP-2劑量多少、處理方式如何、多種細胞因子之間的相互調(diào)控作用等，都有可能影響其生物功能，難以充分發(fā)揮其作用。另外，外源性BMP-2半衰期短，需大劑量才能刺激足量骨形成，從而容易產(chǎn)生毒性作用。因此，外源性生長因子的應(yīng)用受到了較大的限制，未能在現(xiàn)實中得到有效的推廣。

近年來，由于轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展及運用，使用內(nèi)源性生長因子來加速新骨形成已經(jīng)成為一個新的熱點。Ashinoff等［5］將腺病毒介導的BMP-2直接注射在大鼠下頜骨牽張間隙內(nèi)，發(fā)現(xiàn)新生骨量和骨沉積均顯著增加，尤以固定期的早期為甚。黃旋平等［6］研究證實BMP-2基因修飾自體骨髓間充質(zhì)干細胞移植能有效促進兔下頜骨牽張成骨新骨形成。提示利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，局部基因治療，可能具有廣闊的應(yīng)用前景。但目前基礎(chǔ)研究尚未成熟，效果不確切，轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展也受到了一定的限制。

因此，在牽張成骨理論研究及外固定器械高度發(fā)展的基礎(chǔ)上，尋找一種有效、安全促進骨生長的方法，縮短牽張成骨的固定時間，具有非常重要的意義。祖國醫(yī)學認為：腎為先天之本，腎藏精，主骨生髓；骨的生長、發(fā)育、強弱與腎精盛衰關(guān)系密切。受中醫(yī)中藥研究理論的啟發(fā)，本課題組嘗試將牽張成骨與中醫(yī)中藥結(jié)合起來，為牽張成骨的發(fā)展探尋一條行之有效的途徑。本研究所用中藥骨碎補味苦、性溫，歸肝、腎經(jīng)，具有續(xù)傷鎮(zhèn)痛、補腎固精、活血化瘀、止血之功效，主治腎虛腳軟、跌仆損傷等癥，為中醫(yī)骨傷科常用藥物［7］。現(xiàn)代藥理研究表明骨碎補的主要活性物質(zhì)為骨碎補總黃酮。研究［8］發(fā)現(xiàn)：骨碎補總黃酮對促進骨損傷的愈合有重要作用，它除了可以促進成骨細胞增殖，還能抑制破骨細胞活性，增加骨密度，改善骨質(zhì)量，提高血鈣濃度，抑制骨吸收。

TGF-β是一組具有多種功能的多肽，目前已發(fā)現(xiàn)有5種異構(gòu)體形式，在人體中只存在TGF-β1、2、3三種形式，可由許多正常細胞如單核細胞、成骨細胞、成纖維細胞等產(chǎn)生，在血小板和骨組織中含量最為豐富。TGF-β的生物學功能十分廣泛，在胚胎發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、細胞分化、組織增生、炎癥及損傷修復中都有重要作用，特別在調(diào)節(jié)細胞生長和分化方面，同時能調(diào)控細胞外基質(zhì)蛋白的形成。BMP是TGF-β超家族中的一組多功能細胞因子，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)BMP 1～12。BMP主要由成骨細胞合成及分泌，是一種疏水酸性糖蛋白，其主要生物學作用是誘導未分化的間充質(zhì)細胞分化為成軟骨細胞或成骨細胞，即所謂誘導成骨作用［9］。TGF-β和BMP均為與骨代謝密切相關(guān)的蛋白，其表達水平在一定程度上能影響骨的愈合能力。

本課題組在牽張成骨理論研究的基礎(chǔ)上，應(yīng)用祖國傳統(tǒng)醫(yī)學理論，通過大量的文獻分析，選用中藥骨碎補總黃酮進行干預(yù)，觀察中藥在兔股骨牽張成骨過程中對新骨形成及BMP-2和TGF-β1表達的影響。結(jié)果顯示：在固定第4周時，治療組骨小梁形態(tài)粗大均勻，排列密集，而對照組骨小梁稀疏且粗細不均，表明骨碎補總黃酮在骨牽張區(qū)新生骨質(zhì)的形成和鈣化上有重要作用。通過免疫組織化學染色發(fā)現(xiàn)，治療組胞漿中BMP-2和TGF-β1呈棕色深染，染色程度顯著高于對照組（P＜0.05），表明骨碎補總黃酮能顯著增加骨中BMP-2和TGF-β1的含量，促進成骨細胞分化、增殖，加速骨形成。BMP-2和TGF-β1二者最強表達均見于牽張剛剛結(jié)束的時候，這種表達時段上的一致性說明二者在牽張成骨的過程中可能存在某種協(xié)同作用，其機制有待進一步研究。

本研究首次將骨碎補總黃酮引入牽張成骨治療中，結(jié)果表明其可有效加速新生骨質(zhì)的生成與鈣化。骨碎補總黃酮在牽張成骨中的應(yīng)用研究，為縮短牽張成骨的固定時間提供了一種新的治療思路，進一步促進了骨缺損和骨延長治療的開展。

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【責任編輯：侯麗穎】

Effect of Rhizoma Drynariae Total Flavones on Expression of Bone Morphogenetic Protein 2 and Transforming Growth Factor β1 in Distraction Osteogenesis

GAO Yijia1，HUANG Peizhen1，LI Yue1，JIANG Ziwei1，YANG Bing2，HUANG Feng1，CHEN Jizhang1
（1.Dept.of Orthopedics，the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405 Guangdong，China；2.The First Clinical Medicine School，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405 Guangdong，China）

ObjectiveTo investigate the effect of total flavones of Rhizoma Drynariae on femur distraction osteogenesis in the rabbits.Methods Thirty-two healthy rabbits were randomly divided into treatment group and control group，16 rabbits in each group.The femoral fracture was treated with unilateral femoral distraction and was fixed with a self-made distraction instrument.After 7-day intermittent period，the fractured femur was distracted at a rate of 1 mm/d，twice a day for 10 continuous days.The treatment group was fed with total flavones of Rhizoma Drynariae from the first post-operative day to the end of the experiment.And then all of the animals were sacrificed after fixation for 28 days.The bone specimens were used for histological observation and immunohistochemical detection.Results The area of mature bone in the newborn bone tissue of the treatment group was increased，and osteoblasts number and the percentage of trabecular bone area were significantly higher than those of the control group.The bone morphogenetic protein-2（BMP-2）and transforming growth factor-β1（TGF-β1）were stained brown deeply，the staining degree being stronger than that of the control group.Conclusion Rhizoma Drynariae total flavones can effectively accelerate the formation andmaturation of newborn bone tissue during bone distraction.

distraction osteogenesis；Rhizoma Drynariae total flavones；BMP-2；TGF-β1

R285.5

A

1007-3213（2016）05-0679-05

10．13359/j．cnki．gzxbtcm．2016．05．015

2016-05-04

高怡加（1979-），男，碩士研究生，主治醫(yī)師；E-mail:gaoyijia99@163.com

國家自然青年科學基金資助項目（編號:81403413）；廣東省中醫(yī)藥局建設(shè)中醫(yī)藥強省科研項目（編號:20131164）