雙氫青蒿素逆轉人結腸癌耐藥細胞耐藥性的研究

陶鵬宇，施明杰，黃永焯，王慧媛，徐勤

（1.中國科學院上海藥物研究所，上海　201203；2.廣州中醫藥大學熱帶醫學研究所，廣東廣州　510405）

雙氫青蒿素逆轉人結腸癌耐藥細胞耐藥性的研究

陶鵬宇1，2，施明杰1，黃永焯1，王慧媛1，徐勤2

（1.中國科學院上海藥物研究所，上海201203；2.廣州中醫藥大學熱帶醫學研究所，廣東廣州510405）

【目的】評價雙氫青蒿素逆轉人結腸癌細胞HCT8/ADR耐藥性的能力，研究其逆轉耐藥的機制。【方法】采用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法、流式細胞術分別進行細胞毒性、細胞凋亡實驗評價雙氫青蒿素和阿霉素聯合用藥的藥效，采用Western blot法研究逆轉耐藥的機制。【結果】雙氫青蒿素和阿霉素聯用后對人結腸癌耐藥細胞有較高的毒性，能誘導耐藥細胞凋亡，增強耐藥細胞的自噬。【結論】雙氫青蒿素能逆轉耐藥性，恢復耐藥細胞對化療藥物的敏感性。

雙氫青蒿素；結腸癌/中西醫結合療法；耐藥；自噬；細胞培養；細胞凋亡

結腸癌是常見的惡性腫瘤，化療藥物治療是最常用的治療手段之一，然而其療效常常受多藥耐藥性（multidrug resistance，MDR）的限制［1］。腫瘤多藥耐藥的發生涉及多種機制，包括ATP結合盒（ATP-binding cassette，ABC）轉運蛋白的高表達［2］，對藥物誘導的DNA損傷修復能力的增強［3］，細胞自噬的誘導［4］，細胞凋亡途徑的抑制及抗凋亡機制的增強［5］等。

青蒿為菊科植物黃蒿Artemisia annua L.的干燥地上部分，其抗瘧作用的主要有效成分為青蒿素。雙氫青蒿素（DHA）是青蒿素衍生物，具有水溶性強、易吸收、代謝排泄迅速、毒副作用弱等優勢［6］。雙氫青蒿素在治療耐氯喹或對其他多種藥物耐藥的腦型瘧和惡性瘧時有特效［7］，在治療血吸蟲、抗炎、免疫調節、抑制瘢痕增生等方面也表現出明顯的調節功能［8］。近年來，雙氫青蒿素的抗腫瘤活性亦引起了人們的關注。

本研究以人結腸癌耐藥細胞HCT8/ADR為研究對象，考察雙氫青蒿素與阿霉素（DOX）聯合應用對該細胞的增殖抑制、誘導凋亡的作用，并采用Western blot法對雙氫青蒿素逆轉耐藥的作用機制進行了初步的研究，從而為中藥聯合化療藥物治療腫瘤提供新的思路，現報道如下。

1　材料與方法

1.1藥物、試劑與儀器雙氫青蒿素（DHA，批號：MB 6911）和阿霉素（DOX，批號：MB 1087）均購于大連美侖生物技術有限公司。β-巰基乙醇、過硫酸銨、異丙醇、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉（SDS）、溴酚藍、甲醇、二甲基亞砜、碘化丙啶（PI）等均購于國藥集團化學試劑有限公司；RMPI-1640細胞培養基干粉、胎牛血清購于美國Gibco公司；異硫氰酸熒光素（FITC）標記的重組人磷脂結合蛋白Annexin V（Annexin V-FITC）細胞凋亡檢測試劑盒、2，2-聯喹啉-4，4-二甲酸二鈉（BCA）蛋白濃度測定試劑盒購于碧云天生物技術公司；抗微管相關輕鏈蛋白LC3抗體、抗細胞周期相關蛋白Cyclin D1抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG（H+L）抗體均購于美國Abcam公司。微孔濾膜（美國Millipore公司）；LDZX-50KBS高溫高壓滅菌鍋（上海申安醫療器械）；X85-2磁力加熱攪拌器（上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司）；EPS300電泳儀（上海天能科技有限公司）；GelDoc XR凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）；Mini-protein電泳儀（美國Bio-Rad公司）；1510全波長酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；LA850酸度計（德國SCHOTT集團）；TS-1000脫色搖床（海門市其林貝爾儀器公司）；R8-1渦旋混合器（中國北京吳諾斯科技有限公司）；HF90細胞培養箱（中國Heal Force生物醫療科技控股有限公司）；培養基抽濾器（美國Nalgene公司）；Beckaman MICR OLUGE16小型臺式離心機（美國Beckman Coulter有限公司）；XDS-1R倒置顯微鏡（意大利Optika公司）；細胞計數板（上海醫療設備廠）；Ultra pure plus 12-A純水儀（上海和泰儀器公司）。

1.2細胞株及細胞培養人結腸癌耐藥細胞株HCT8/ADR及母本細胞株HCT8由中科院上海藥物所丁健研究員贈予。用含體積分數10%胎牛血清的RPIM-1640培養基，在體積分數5%CO2、37°C的培養箱中連續培養。

1.3雙氫青蒿素和阿霉素聯用對腫瘤細胞的增殖抑制采用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法測定雙氫青蒿素和阿霉素聯用的抗腫瘤增殖能力。消化、收集對數生長期的HCT8/ADR細胞，以5×103/孔的密度接種于96孔板，繼續培養24 h。實驗組為阿霉素組、雙氫青蒿素組、阿霉素和雙氫青蒿素聯用組，共計3組，另設空白對照組。按照實驗設計方案加入相應濃度的藥物，濃度如下：阿霉素組為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mg/L；雙氫青蒿素組為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mg/L；阿霉素和雙氫青蒿素聯用組分別固定雙氫青蒿素濃度為5 mg/L和10 mg/L，阿霉素濃度依次為0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5 mg/L；每個濃度設置6個復孔。48 h后，向每孔加入20 μL MTT溶液，培養箱中孵育4 h，吸去培養液，每孔加入200 μL DMSO。震蕩1 min，在490 nm下測定吸光度（D）值，按以下公式計算細胞存活率：p細胞存活（%）= D實驗組/D對照組×100%。

1.4雙氫青蒿素和阿霉素聯用誘導腫瘤細胞凋亡

采用Annexin V/PI雙染法測定細胞凋亡率。取對數生長期的HCT8/ADR細胞種于12孔板中，細胞密度為5×104/孔，繼續培養24 h后進行實驗。實驗分為阿霉素、雙氫青蒿素、阿霉素和雙氫青蒿素聯用3組，另設立空白對照組。按照實驗設計方案加入相應濃度的藥物，濃度如下：阿霉素組分別為0.05、0.1 mg/L；雙氫青蒿素組10 mg/L；阿霉素和雙氫青蒿素聯用組固定雙氫青蒿素濃度為10 mg/L，阿霉素濃度分別為0.05、0.1 mg/L。每個濃度設置3個復孔。棄去培養基，加入含不同樣品的含體積分數10%血清的細胞培養基，每孔0.5 mL，繼續培養24 h。胰酶消化，離心收集細胞，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌，分別加入Annexin V-FITC 和PI染色液，在30 min內進行流式細胞儀檢測。Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。

1.5微管相關蛋白輕鏈3（LC3-II）和細胞周期蛋白（Cyclin D1）的檢測采用Western blot方法，檢測相關蛋白在HCT8/ADR上的表達情況。各組藥物濃度分別為雙氫青蒿素10 mg/L，阿霉素0.1 mg/L，雙氫青蒿素10 mg/L+阿霉素0.1 mg/L。每個濃度設置3個復孔。給藥48 h后，胰酶消化，離心收集細胞，置于冰上，加入預冷的細胞裂解液裂解破碎細胞，4°C裂解30 min。4°C、12 000 r/min離心10 min，吸取上清，采用BCA定量試劑盒測定蛋白濃度。在樣品中加入緩沖液，煮沸5 min使蛋白質變性，采用十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳法（SDS-PAGE）分離，轉膜后進行非特異性封閉，加入LC3、Cyclin D1抗體4°C孵育過夜，然后用含有體積分數0.1%吐溫20的三（羥甲基）氨基甲烷—鹽酸（Tris-HCl）緩沖鹽溶液洗3次，加入二抗孵育1 h。顯色，洗膜后，成像檢測。采用Image J2軟件進行圖片灰度分析，對蛋白表達進行半定量分析。

1.6統計方法采用Origin 9.0統計軟件處理數據，計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗（Student's t test）分析組間差異。

2　結果

2.1雙氫青蒿素和阿霉素聯用對腫瘤細胞的增殖抑制結果在HCT8/ADR細胞中，單獨使用阿霉素或者雙氫青蒿素時，即使在高濃度（10 mg/L），細胞存活率仍維持在80%以上（圖1）；而當雙氫青蒿素以5 mg/L的濃度與阿霉素聯合使用時，實驗組在阿霉素濃度為 1.5 mg/L時就可以將細胞存活率降到50%。如果進一步將雙氫青蒿素的給藥量增至10 mg/L，細胞存活率在阿霉素濃度為0.05 mg/L時即可降至50%以下（圖2）。高濃度（10 mg/ L）與低濃度（5 mg/L）雙氫青蒿素處理組的細胞存活率比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。表明雙氫青蒿素可以增強化療藥物對耐藥細胞的毒性。

圖1　不同濃度雙氫青蒿素和阿霉素對HCT8/ADR的細胞毒性實驗結果Figure 1　Cytotoxicity test of HCT8/ADR treated with the same concentration of DOX or DHA　（±s，N=6）

2.2細胞凋亡結果正常的活細胞（Q4區，左下）不能被Annexin V-FITC和PI染色，凋亡晚期細胞（Q2區，右上）可以同時被Annexin V-FITC和碘化丙啶（PI）染色，而凋亡早期細胞（Q3區，右下）僅能被Annexin V-FITC染色。圖3結果顯示：在相同阿霉素濃度（0.05 mg/L）下，聯合用藥組發生早期和晚期凋亡的細胞比例為25.54%，游離阿霉素組僅為4.15%，聯合用藥組與DOX組、DHA組比較，差異均有統計學意義（P＜0.01）。如果進一步增加阿霉素濃度（0.1 mg/L），則聯合用藥組的凋亡細胞比例上升至42%，游離阿霉素組僅為6.29%。圖4結果表明：聯合用藥組的細胞凋亡比例與單藥組比較，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01），表明聯合用藥組能顯著引起耐藥細胞HCT8/ADR的細胞凋亡。

圖2　聯合用藥對HCT8/ADR的細胞毒性實驗結果Figure 2　Cytotoxicity test of HCT8/ADR treated with DOX combined with 5 or 10 mg/L DHA　（±s，N=6）

2.3各組自噬相關蛋白的表達圖5、圖6結果顯示：48 h后阿霉素組HCT8/ADR細胞的LC3-Ⅱ表達量與空白對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；雙氫青蒿素組和聯合給藥組LC3-Ⅱ表達量均上調，但聯合給藥組LC3-Ⅱ的表達顯著增高（P ＜0.01），自噬活性最高。雙氫青蒿素組和聯合給藥組可顯著抑制Cyclin D1表達，與空白對照組比較，差異均有統計學意義（P＜0.01），這也從另一方面證實了雙氫青蒿素可以促進耐藥細胞的自噬。

3　討論

近年來，通過大量研究證實，聯合用藥可以在抗腫瘤治療中發揮重要作用，其通過把不同殺傷作用機制的抗腫瘤藥物（或治療方法）聯合起來通過協同作用把較微弱的死亡信號放大，降低腫瘤細胞對細胞毒藥物的耐藥性，增強抗腫瘤藥物對腫瘤的殺傷作用，確保發生有效的細胞凋亡［9］。因此，抗腫瘤藥物聯合作用可以作為一種克服單一藥物治療阻礙的有效治療策略。而且，低濃度藥物的聯合作用對于臨床治療更具有可行性，可以減輕毒副作用、改善患者體質、延長壽命和改善生活質量［10］。克服腫瘤耐藥性的治療策略已從最初的單一用藥向聯合用藥方向轉變，從機制的互補、作用的協同、不良反應的減輕等方面發揮作用。

圖3　各組HCT8/ADR細胞凋亡流式細胞圖Figure 3　The cell apoptosis test in HCT8/ADR

圖4　各組處理后凋亡細胞比例比較Figure 4　The apoptotic rate of each group after treatment with DOX，DHA and their combination　（±s，N=3）

圖5　各組LC3和Cyclin D1表達凝膠電泳圖Figure 5　LC3 and Cyclin D1 protein expression in HCT8/ ADR cells detected by gel electrophoresis

圖6　各組LC3和Cyclin D1的表達半定量分析結果比較Figure 6　Semi-quantitative analysis of LC3-Ⅱand Cyclin D1 protein expression in HCT8/ADR cells after treatment　（±s，N=3）

LC3是參與自噬泡形成的重要蛋白，分為I型和II型。細胞中新合成的LC3經過加工，成為胞漿可溶性LC3-I。LC3-I經泛素化加工修飾，與自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺（PE）結合，轉變為LC3-II，這一進程是自噬過程中必不可少的階段。因此，LC3-II是自噬發生的特異性標記蛋白，LC3-II的含量及LC3-II與LC3-I的比例可標志自噬體的數量和自噬發生的程度［11］。

真核細胞的分裂周期遵循G1-S-G2-M演變規律，細胞周期蛋白Cyclin D1在細胞G1/S轉換過程中發揮關鍵作用，決定細胞是否進入分裂周期和繼續增殖，是細胞周期進程的調節分子。目前已在一些人類癌癥細胞中發現Cyclin D1的過度表達［12］。Cyclin D1能夠通過泛素化降解［13］；細胞內另一個重要的降解機制是自噬，自噬也同樣會引起Cyclin D1的降解［14］。因而，將自噬作為治療靶點是克服腫瘤細胞多藥耐藥的一個重要策略。

近年來，對自噬在腫瘤細胞耐藥機制中的作用研究有著2種截然不同的觀點。一部分研究發現激活自噬能夠引起化療耐受，作為一種保護機制對腫瘤細胞起到保護作用［15-17］。但另有文獻報道自噬有助于化療增敏，例如，Lee等［18］報道組蛋白去乙酰化酶抑制劑SAHA通過誘導自噬相關的細胞死亡而殺傷耐藥乳腺癌細胞；Yang等［19］則發現一種ATP競爭性的PI3K/mTOR抑制劑類新藥NVP-BEZ235通過直接激活自噬和阻滯細胞周期殺傷對順鉑耐藥的尿路上皮癌細胞；伊馬替尼可通過增強自噬逆轉卡波濟氏肉瘤對阿霉素的耐藥性［20］。因此，將自噬作為治療靶點是克服腫瘤細胞多藥耐藥的一個重要策略。

國內外研究發現，雙氫青蒿素能通過促進細胞凋亡對多種腫瘤細胞產生殺傷作用［21-23］；青蒿素的衍生物也能夠增強腫瘤細胞對放療的敏感性［24-25］。本研究結果顯示：聯合雙氫青蒿素和阿霉素處理耐藥細胞促進了細胞凋亡；檢測各處理組細胞的自噬水平后發現，聯合給藥組LC3-II的蛋白表達量顯著增高，而Cyclin D1的表達量顯著降低。通過細胞毒性和凋亡實驗證明了雙氫青蒿素可以通過增強自噬的方式恢復人結腸癌耐藥細胞HCT8/ADR對阿霉素的敏感性，具有逆轉耐藥的作用。這為臨床治療多藥耐藥腫瘤提供了一個新的研究方向。

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【責任編輯：黃玲】

Reversal of Multidrug Resistance of Human Colon Cancer Cells by Dihydroartemisin

TAO Pengyu1，2，SHI Mingjie1，HUANG Yongzhuo1，WANG Huiyuan1，XU Qin2
（1.Shanghai Medicine Institute of Chinese Academy of Sciences，Shanghai 201203，China；2.Tropical Medicine Institute，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405 Guangdong，China）

Objective To investigate the multidrug-resistance reversal action and mechanism of dihydroartemisin （DHA）on human colon cancer cell line HCT8/ADR.Methods The cytotoxicity of dihydroartemisin combined with doxorubicin（DOX）was determined by methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）assay and cell apoptosis was observed by flow cytometry.Western blot assay was used to measure the autophagy.Results The combined treatment with dihydroartemisin and doxorubicin significantly enhanced the cytotoxicity in HCT8/ADR cells and effectively increased the apoptotic level.Autophagy was also induced by the combined treatment，which maybe played a crucial role in the regulation of doxorubicin-sensitization of HCT8/ADR cells.Conclusion The results indicated that dihydroartemisin can reverse multidrug resistance through increasing the doxorubicin-sensitivity of HCT8/ADR cells.

dihydroartemisin；colonic cancer/TCM-WM therapy；multidrug resistance；autophagy；cell culture；apoptosis

R285.5

A

1007-3213（2016）05-0698-06

10.13359/j.cnki.gzxbtcm.2016.05.019

2016-05-01

陶鵬宇（1989-），男，碩士研究生；E-mail:1120821481@qq.com

王慧媛（1985-），女，副研究員；E-mail:wanghuiyuan@simm.ac.cn；徐勤（1963-），男，教授；E-mail:xuqin@163.com

國家自然科學基金資助項目（編號:81402883）；中國科學院設備研制項目（編號:YZ201437）；廣東省科技計劃項目（編號: 2015A040404042）