燕窩提取物抗H5N1禽流感病毒的作用及機理研究

林潔茹，張瑩，戴衛平，劉叔文，李耿，周華，賴小平

（1.廣州中醫藥大學中藥學院，廣東廣州　510006；2.南方醫科大學藥學院，廣東廣州　510515；3.澳門科技大學，澳門）

燕窩提取物抗H5N1禽流感病毒的作用及機理研究

林潔茹1，張瑩1，戴衛平1，劉叔文2，李耿1，周華3，賴小平1

（1.廣州中醫藥大學中藥學院，廣東廣州510006；2.南方醫科大學藥學院，廣東廣州510515；3.澳門科技大學，澳門）

【目的】觀察燕窩提取物體外抑制H5N1禽流感病毒的作用。【方法】制備燕窩水提物、燕窩水提物人工胃液消化物、燕窩水提物人工腸液消化物。通過體外293T細胞轉染方法，應用熒光素酶檢測試劑盒檢測3種燕窩提取物對H5N1禽流感假病毒、VSV-G假病毒活性的影響；觀察禽流感病毒H5、H7、H9 3種亞型抗原凝血反應及3種燕窩提取物對其抑制作用；應用神經氨酸酶抑制劑篩選試劑盒檢測3種燕窩提取物對N1型神經氨酸酶（NA）活性的影響。【結果】3種燕窩提取物對H5N1禽流感假病毒活性均有抑制作用，抑制作用的強度隨燕窩提取物濃度增高而增加，其中人工腸液消化物作用最強，水提取物最弱，但對VSV-G假病毒活性均無顯著抑制作用。H5、H7型抗原凝血價為1∶128，H9型抗原凝血價為1∶256，3種燕窩提取物在一定濃度條件下對H5、H7、H9抗原血凝反應均有抑制作用，但對NA均沒有抑制作用。【結論】燕窩提取物抗病毒的作用可能是通過抑制血凝素的活性而實現的。

燕窩提取物/藥理學；H5N1禽流感病毒；細胞轉染；凝血反應

燕窩是一種名貴的中藥材，具有潤肺滋陰、化痰止咳、益氣補中的功效［1］，闡明燕窩的生物活性具有重要的意義。燕窩含大量唾液酸。研究［2］表明，唾液酸及其衍生物在抗流感病毒、輪狀病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒等方面有重要作用。可見，燕窩抗病毒作用是值得深入研究的方向。H5N1高致病性禽流感是人、禽和其他哺乳動物共患的一種傳染病，發病人群年齡偏低、病死率高［3］。本研究因此以H5N1禽流感病毒為研究對象，觀察燕窩提取物體外對H5N1病毒的抑制作用，為進一步評價燕窩的價值和功效、產品研發和代用品研究提供參考，現將研究結果報道如下。

1　材料與方法

1.1實驗藥物印度尼西亞白燕窩，由新加坡錦興公司提供，經廣州中醫藥大學賴小平教授采用傳統性狀鑒定方法鑒定為中藥燕窩。

1.2細胞株人腎上皮細胞系293T細胞，由南方醫科大學藥學院饋贈。

1.3主要儀器與試劑5810R臺式冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；Infinite M200 Pro多功能酶標儀（瑞士Tecan公司）；HH-2恒溫水浴鍋（江蘇金壇市宏華儀器廠）；DYCZ-24DN垂直電泳儀、Moder GS-800光密度掃描儀（美國Bio-Rad公司）。胃蛋白酶（美國Amreseo公司，批號：2588B243）；胰蛋白酶（美國Life Technologies公司，生產批號：1732496）；細胞裂解液（美國Promega公司，批號：E1531）；熒光素酶檢測試劑盒（美國Promega公司）；神經氨酸酶抑制劑篩選試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；H5、H7、H9禽流感病毒3種亞型血凝抗原由南方醫科大學藥學院饋贈。

1.4質粒pHA-H5質粒、pNA-Nl質粒、pVSVG質粒、pNL4-3.Luc.R-E-質粒由南方醫科大學藥學院饋贈。①pHA-H5和pNA-N1質粒：是在pCMV質粒基礎上構建表達血凝素（HA）和神經氨酸酶（NA）的質粒，其中HA和NA為H5N1的基因序列。2個質粒分別用RT-PCR獲得H5N1的HA 和NA的cDNA，經雙酶切后定向克隆到pCMV真核表達載體，并經DNA序列分析鑒定，確認序列正確。②PNL4-3.Luc.R-E-質粒：是1個表達熒光素酶（luciferase），且存在Vpr基因缺陷（R-）和包膜蛋白缺陷（E-）的HIV質粒。PNL4-3是具有HIV全長序列，可以復制和感染的嵌合體DNA。PNL4-3.Luc.R-E-是由PNL4-3改造而來的，對PNL4-3的HIV的Vpr基因和Env（包膜蛋白）基因的閱讀框架移位，使其不表達這兩個蛋白，喪失了感染性。Vpr基因表達的蛋白稱為病毒蛋白R，其介導HIV的基因進入細胞核進行基因整合，R的缺失保證了假病毒的安全性。同時，PNL4-3的Nef基因上插入了熒光素酶基因，使其能用Promega的熒光素酶試劑盒對病毒進行定量檢測。PNL4-3.Luc.R-E-需要與表達包膜蛋白的質粒共轉染293T細胞才可以產生假病毒。

1.5樣品制備

1.5.1燕窩水提物制備（編號：A）取燕窩粉末適量，加300 mL雙蒸水室溫浸泡2 h，80℃提取l h，4℃放置備用。

1.5.2燕窩水提物人工胃液消化物的制備（編號：B）人工胃液配制：NaCl 2.0 g，胃蛋白酶3.2 g，濃鹽酸7 mL，雙蒸水定容1 000 mL，pH為1.2。取1 支1.5 mL滅菌離心管，加入2×人工胃液100 μL，37℃保溫10 min。然后加入樣品A 100 μL（37℃預熱），37℃消化1 min，加入0.168 mol/L Na2CO3調整pH值為7～8以終止反應。

1.5.3燕窩水提物人工腸液消化物的制備（編號：C）人工腸液配制：將KH2PO46.8 g溶于250 mL雙蒸水，振蕩，完全溶解后加190 mL 0.2 mol/L NaOH 和400 mL雙蒸水。加胰蛋白酶10.0 g，混勻，用0.2 mol/L NaOH調pH到7.5，雙蒸水定容于1 000 mL。取1支1.5 mL滅菌離心管，加入2×人工腸液100 μL，37℃保溫10 min。然后加入樣品A 100 μL（37℃預熱），37℃消化1 min，90℃加熱5 min以終止反應。

燕窩A、B、C用磷酸鹽緩沖液（PBS）溶解，母液為10 mg/mL，在做假病毒實驗時用完全培養基（體積分數90%DMEM+體積分數10%胎牛血清+體積分數1%青霉素和鏈霉素，pH=7.2）稀釋到合適濃度。

1.63種燕窩提取物對H5N1禽流感假病毒的作用將pHA-H5和pNA-N1同時與1個表達熒光素酶且包膜蛋白與Vpr基因缺陷的HIV質粒pNL4-3. Luc.R-E-采用磷酸鈣法［4］共轉染 293T細胞8～16 h后，換細胞完全培養液，在37℃、含體積分數5%CO2的培養箱中繼續培養48 h，收獲H5N1假病毒上清，于-80℃保存。將3種燕窩提取物50 μL分別加入到接種293T細胞（1×104/孔）的96孔板內孵育1 h，然后加入50 μL 10×細胞培養液稀釋的H5N1假病毒，培養48 h后，加入細胞裂解液裂解細胞30 min，按照熒光素酶檢測試劑盒操作方法加樣后分別在多功能酶標儀上檢測化學發光值（D），吸收波長535 nm。根據D值判斷燕窩提取物對H5N1假病毒活性的抑制作用。

1.73種燕窩提取物對H5N1禽流感病毒包膜蛋白的特異性作用為判斷燕窩提取物是否特異性地作用于H5N1禽流感病毒的包膜蛋白，本研究采用表達VSV-G的假病毒進行驗證。該假病毒與H5N1禽流感病毒比較，僅包膜蛋白不一樣。將VSV病毒的包膜蛋白質粒pVSV-G與pNL4-3.Luc.R-E-質粒采用磷酸鈣法［4］共轉染293T細胞8～16 h后，換細胞完全培養液，在37℃、含體積分數5%CO2的培養箱中繼續培養48 h，收獲VSV-G假病毒上清，于-80℃保存。將3種不同濃度的燕窩提取物50 μL分別加入接種293T細胞（1×104/孔）的96孔板內孵育1 h，然后加入50 μL 10×細胞培養液稀釋的VSV-G假病毒，培養48 h后，加入細胞裂解液裂解細胞30 min，按照熒光素酶檢測試劑盒操作方法加樣后分別在多功能酶標儀上檢測化學發光值（D），判斷燕窩提取物對包膜蛋白的抑制作用。

1.8燕窩提取物抑制H5、H7、H9抗原血凝實驗①測定血凝價：在96孔微量反應板上，自左至右各孔加25 μL生理鹽水；于左側第1孔分別加50 μL H5、H7、H9型抗原溶液，混合均勻后，吸25 μL至第2孔，依次2倍倍比稀釋至第11孔，吸棄25 μL；第12孔以PBS作為對照。自右至左依次向各孔加入體積分數為1%雞紅細胞懸液25 μL（由成年健康公雞血液，以38 g/L枸椽酸鈉溶液1∶4抗凝，加5×生理鹽水洗滌，1 500 r/min離心5 min，洗滌3次，取沉淀紅細胞用生理鹽水稀釋而成），在振蕩器上振蕩，室溫下靜置，待雞紅細胞沉淀即可觀察結果。若紅細胞全部凝集，沉于孔底，平鋪呈網狀，即為100%凝集（++++），不凝集者（-）紅細胞沉于孔底呈點狀。以100%凝集的病毒最大稀釋度為該病毒血凝價，即為1個凝集單位。②測定燕窩提取物對H5、H7、H9抗原引起凝血的抑制作用：將不同濃度的提取物（25 μL）與4個血凝單位的H5、H7、H9型陽性抗原溶液（25 μL）混勻，再加入體積分數為1%雞紅細胞懸液25 μL，在振蕩器上振蕩，室溫下靜置，待雞紅細胞沉淀即可評價凝血結果。

1.93種燕窩提取物抗神經氨酸酶活性的作用收集各組燕窩提取物細胞培養液上清，按照神經氨酸酶抑制劑篩選試劑盒操作方法，對空白對照組、NA對照組、燕窩提取物A、B、C組進行酶活力檢測。96孔黑色微量板中加入50 μL底物及細胞培養液上清50 μL，混勻后避光置于37℃孵育60 min，每孔加入100 μL終止液終止反應。在多功能酶標儀上測定熒光值（D），熒光激發波長340 nm，吸收波長535 nm，計算燕窩提取物對神經氨酸酶活性的抑制率。計算公式如下：p抑制率（%）=［1-（D藥物組-D空白對照組）/（DNA對照組-D空白對照組）］×100%。

2　結果

2.13種燕窩提取物對H5N1禽流感假病毒的作用圖1結果顯示：3種燕窩提取物對H5N1禽流感假病毒活性均有抑制作用，抑制作用的強度隨燕窩提取物濃度增高而增加，3種提取物的作用曲線呈大致平行走向。3種提取物最高抑制率均超過93%。

表1結果顯示：3種燕窩提取物中，人工腸液消化物（C）的作用最強，IC50為（2.30±0.62）μg/mL；人工胃液消化物（B）的作用次之，IC50為（4.00± 3.60）μg/mL；水提取物（A）最弱，IC50為（5.29± 1.79）μg/mL。

圖1　3種不同濃度的燕窩提取物對H5N1假病毒的抑制作用Figure 1　The inhibitory effect of 3 kinds of Nidus Collocaliae extracts at different concentrations on H5N1 pseudoviruses

表1　3種燕窩提取物對H5N1假病毒抑制作用的半數有效濃度Table 1　IC50of 3 kinds of Nidus Collocaliae extracts against H5N1 pseudoviruses

2.23種燕窩提取物對禽流感病毒包膜蛋白的作用圖2結果顯示：3種燕窩提取物對VSV-G假病毒活性均無顯著的抑制作用，表明其作用位點可能是包膜蛋白。

2.3燕窩提取物抑制H5、H7、H9亞型抗原血凝實驗

2.3.1H5、H7和H9亞型抗原的血凝價表2結果顯示：將不同稀釋度的H5、H7、H9亞型抗原與雞紅細胞懸液孵育，H5和H7亞型抗原均在稀釋度為1∶8 至1∶128時引起血凝反應，而從1∶256開始即不再發生血凝反應，表明其血凝價為1∶128。H9亞型抗原在1∶512不再發生血凝反應，表明其血凝價為1∶256。所以，后續實驗均按血凝價為1∶128觀察燕窩提取物對H5、H7亞型抗原血凝的影響，按血凝價為1∶256觀察燕窩提取物對H9亞型抗原血凝的影響。

圖2　3種不同濃度燕窩提取物對VSV-G假病毒包膜蛋白的作用Figure 2　The inhibitory effect of 3 kinds of Nidus Collocaliae extracts at different concentrations against envelope protein of VSV-G pseudoviruses

表2　H5、H7和H9亞型抗原的血凝實驗Table 2　Blood clotting response test for H5，H7 and H9 type antigens

2.3.23種燕窩提取物對H5、H7、H9亞型抗原凝血反應的拮抗作用

2.3.2.13種燕窩提取物對H5亞型抗原發生血凝反應的影響表3結果顯示：3種燕窩提取物在一定濃度條件下對H5抗原血凝反應均有抑制作用，樣品A、B、C抑制H5抗原發生血凝反應的最低有效濃度分別為 5.21 μg/mL，10.4 μg/mL和10.4 μg/mL。

表3　3種燕窩提取物對H5亞型抗原發生血凝反應的影響Table 3　The effect of 3 kinds of Nidus Collocaliae extracts on blood clotting response to H5 antigen

2.3.2.23種燕窩提取物對H7亞型抗原發生血凝反應的影響表4結果顯示：3種燕窩提取物在一定濃度條件下對H7抗原的血凝反應均有抑制作用，樣品A、B、C抑制H7抗原發生血凝反應的最低有效濃度分別是5.21 μg/mL，10.4 μg/mL和5.21 μg/mL。

表4　燕窩提取物對H7亞型抗原血凝反應的影響Table 4　The effect of 3 kinds of Nidus Collocaliae extracts on blood clotting response to H7 antigen

2.3.2.33種燕窩提取物對H9亞型抗原發生血凝反應的影響表5結果顯示：3種燕窩提取物在一定濃度條件下對H9抗原的血凝反應均有抑制作用，樣品A、B、C抑制H9抗原血凝反應的最低有效濃度分別是2.60 μg/ml、5.21 μg/mL和5.21 μg/mL。

表5　3種燕窩提取物對H9亞型抗原發生血凝反應的影響Table 5　The effect of 3 kinds of Nidus Collocaliae extracts on blood clotting response to H9 antigen

2.43種燕窩提取物抗神經氨酸酶活性的作用采用神經氨酸酶（NA）抑制劑篩選試劑盒對3種燕窩提取物（終濃度為1 mg/mL，3個復孔）是否具備抑制神經氨酸酶活性的作用進行了初步研究。圖3結果顯示：3種提取物對神經氨酸酶均沒有抑制作用。

3　討論

H5N1禽流感假病毒能夠感染人胚腎293T靶細胞，并在細胞內復制，通過化學發光法檢測在病毒復制過程中共同表達的熒光素酶，即可判斷病毒在靶細胞內有無復制以及復制的程度，這已是一個成熟的篩選H5N1禽流感病毒抑制劑的系統，并已成功用于多種抗病毒藥物的篩選［5］。因此，本研究選擇了此系統研究燕窩提取物的抗病毒作用。

圖3　3種燕窩提取物對神經氨酸酶活性的影響Figure 3　The effect of 3 kinds of Nidus Collocaliae extracts on neuraminidase activity

血凝素（HA）和神經氨酸酶（NA）這2種糖蛋白對于病毒的傳播起著決定的作用。當禽流感病毒進入宿主呼吸道，與上皮細胞接觸后，血凝素就會與上皮細胞表面的唾液酸結合，介導細胞將病毒吞入胞內。進入細胞后，病毒就會將其遺傳物質釋放出來，利用細胞內的核酸復制機制，大量復制病毒自身的遺傳物質和蛋白質，并利用細胞膜將其重新包裝成新的病毒顆粒，以出胞的形式轉移到細胞外，新的病毒顆粒通過血凝素與細胞的唾液酸仍然連接在細胞上［6-9］。另外，血凝素還具有凝集多種紅細胞的性質。

本研究結果顯示：3種燕窩提取物可抑制H5N1禽流感假病毒對293T細胞的感染活性，但對VSV-G假病毒感染293T細胞的活性均無影響，表明提取物的作用靶點為H5N1禽流感病毒的包膜蛋白，即H5型血凝素或N1型神經氨酸酶。血凝反應實驗結果顯示：3種燕窩提取物對H5、H7、H9型抗原引起的血凝反應均有抑制作用，但對神經氨酸酶無抑制作用，表明燕窩抗病毒的作用位點在血凝素，而不是神經氨酸酶。

本研究結果還顯示：燕窩提取物對H9亞型抗原血凝反應的抑制作用較其對H5和H7亞型的作用略強，抑制H9亞型抗原發生凝血反應的最低有效濃度比對H5和H7亞型的低1個血凝單位，提示燕窩的抗病毒作用可能存在一定的選擇性。3種燕窩不同提取物起到抑制H5、H7、H9亞型抗原血凝反應的最低有效濃度均介于2.60～10.4 μg/ mL，但水提取物最低有效濃度低于人工胃液和人工腸液水解產物，表明水提取物的活性較強，而胃液或腸液對水提取物活性有輕度減弱作用，提示胃液和腸液在水解過程中可能破壞了其部分活性成分。

本實驗目前僅采用體外試驗進行了燕窩抗H5N1病毒的藥效評價，雖然取得了令人鼓舞的初步結果，但仍存在一些問題，如未進行體內抗病毒試驗、燕窩水解過程的優化、水解產物的分離純化及其活性評價等，這些都有待下一步研究。

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［3］呂敏.H5N1型高致病性禽流感研究進展及其對人類的威脅［J］.中南大學學報（醫學版），2007，32（1）：15.

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【責任編輯：侯麗穎】

Effect and Mechanism of Extracts of Nidus Collocaliae on Resisting Avian Influenza A H5N1 Virus

LIN Jieru1，ZHANG Ying1，DAI Weiping1，LIU Shuwen2，LI Geng1，ZHOU Hua3，LAI Xiaoping1
（1.School of Chinese Herbal Medicine，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006 Guangdong，China；2.School of Pharmacy，Southern Medical University，Guangzhou 510515 Guangdong，China；3.Macau University of Science and Technology，Macau）

ObjectiveTo observe the inhibitory effect of the extracts of Nidus Collocaliae on avian influenza A H5N1 virus in vitro.Methods Nidus Collocaliae water extract，artificial gastric juice digestion products of Nidus Collocaliae water extract，and artifitial intestinal juice digestion products of Nidus Collocaliae water extract were prepared for the experimental study.293T cells transfection in vitro was carried out.The effects of 3 kinds of Nidus Collocaliae extracts on H5N1 pseudovirus and VSV-G pseudovirus were determined by luciferase detection kit.Blood clotting response to erythrocyte hemagglutinin subtypes H5，H7，H9 antigens and the inhibitory effects of 3 kinds of Nidus Collocaliae extracts were observed.The effects of 3 kinds of Nidus Collocaliae extracts on neuraminidase activity were determined by neuraminidase inhibitor screen kit.Results The 3 kinds of Nidus Collocaliae extracts had inhibitory effects on H5N1 avian influenza pseudovirus，the effects being enhanced with the increase of the concentrations of Nidus Collocaliae extracts.Of the 3 extracts，artificial intestinal digestion products had the strongest inhibitory effect，while Nidus Collocaliae water extract had the weakest effect. However，Nidus Collocaliae extracts had no obvious effect on VSV-G pseudovirus.The concentration of H5，H7 antigen for positive blood clotting response was 1∶128，and that of H9 antigen was 1∶256.The 3 kinds ofNidus Collocaliae extracts at certain concentrations could inhibit blood clotting response to H5，H7，H9 antigen，but had no obvious effect on neuraminidase.Conclusion The anti-H5N1 virus effect of Nidus Collocaliae extracts has been achieved probably through resisting hemagglutinin.

Nidus Collocaliae/pharmacology；avian influenza A H5N1 virus；cell transfection；blood clotting response

R285.5

A

1007-3213（2016）05-0710-06

10．13359/j．cnki．gzxbtcm．2016．05．021

2015-12-08

林潔茹（1973-），女，副主任中藥師；E-mail:linjerry07@qq.com

賴小平，男，教授，博士研究生導師；E-mail:lxp88@gzucm.edu.cn

“十二·五”國際科技合作項目（編號:2014DFH30010）；廣東省科技計劃項目（編號:2013B090800052、2013B020224005）；廣東普通高校國家級重大培育項目（編號:E1-KFD015151K02）