寬體金線蛭油酸的氣相色譜指紋圖譜

黃勇，左智力，楊益林，張?jiān)略疲f范，趙成堅(jiān)，繆劍華

（1.廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，廣西南寧　530023；2.成都動(dòng)物園，四川成都　610081；3.廣西壯族自治區(qū)分析測試研究中心，廣西南寧　530022）

·中藥質(zhì)量與控制·

寬體金線蛭油酸的氣相色譜指紋圖譜

黃勇1，左智力2，楊益林3，張?jiān)略?，韋范1，趙成堅(jiān)1，繆劍華1

（1.廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，廣西南寧530023；2.成都動(dòng)物園，四川成都610081；3.廣西壯族自治區(qū)分析測試研究中心，廣西南寧530022）

【目的】建立寬體金線蛭油酸的氣相色譜指紋圖譜。【方法】以不同來源地和不同規(guī)格的共10批寬體金線蛭為研究對(duì)象，選擇Agilent 6890N型氣相色譜儀，DB-WAX色譜柱 （30 mm×0.32 mm×0.25 μm），氣化溫度為270℃，柱溫130℃，檢測器（FID）溫度為280℃。采用中國藥典委員會(huì)頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A》進(jìn)行相似度計(jì)算。【結(jié)果】不同規(guī)格的寬體金線蛭油酸含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F2，7=7.350，P=0.019），清水曬干品分別和礬品、飲片/曬干的油酸含量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.021，P=0.009）。指紋圖譜的相似度在0.458～0.998之間，其中與其他樣品和對(duì)照指紋圖譜的相似度比較，來源于廣西荔浦的樣品相似度為最低。【結(jié)論】大部分樣品指紋圖譜的相似度非常高，所建立的氣相色譜指紋圖譜可有效鑒別寬體金線蛭的優(yōu)劣品，該方法可為寬體金線蛭的日常質(zhì)量控制提供一定參考。

水蛭；氣相色譜；指紋圖譜

水蛭俗稱為螞蝗，其基源是水蛭科動(dòng)物日本醫(yī)蛭（Hirudo nipponica Whitman）、寬體金線蛭（Whitmania pigra Whitman）或柳葉螞蝗（Whitmania acranulata Whitman）的干燥全體。水蛭在中國藥典（2015）中有收錄［1］，其中寬體金線蛭是國內(nèi)中藥材市場上的主要銷售商品，其味苦咸腥、性平，有小毒，具有破血、逐瘀、通經(jīng)等效用，被廣泛應(yīng)用于臨床治療。寬體金線蛭分布廣泛，傳統(tǒng)上用藥是以野生捕捉為主。寬體金線蛭的人工養(yǎng)殖已開展，規(guī)模逐年增大。然而，不同養(yǎng)殖地的水蛭藥材質(zhì)量差異較大，其臨床療效可能受到嚴(yán)重影響［2］。吸血蛭類如日本醫(yī)蛭含有重要的抗凝物質(zhì)水蛭素，而非吸血蛭類如靠吸吮螺體等動(dòng)物體液生存的寬體金線蛭不含水蛭素，但具有抗凝、抗血栓等作用［3-7］。目前有關(guān)寬體金線蛭的有效藥用成分研究報(bào)道比較少［7］。呂丹等［8］分析了山東微山湖寬體金線蛭的生化成分，認(rèn)為脂肪酸和氨基酸的獨(dú)特組成可能是其高藥用價(jià)值的重要依據(jù)之一。

油酸屬于單不飽和脂肪酸，對(duì)血液總膽固醇和有害膽固醇具有明顯的降低作用，卻不降低有益膽固醇，因此在預(yù)防心血管疾病方面發(fā)揮有效作用［9-10］。寬體金線蛭中油酸（18∶1）的含量在脂肪酸中的含量次高［8］。因此，本研究對(duì)全國不同產(chǎn)地或中藥材市場的寬體金線蛭油酸的氣相色譜指紋圖譜進(jìn)行分析，以期為寬體金線蛭的人工養(yǎng)殖和藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)體系的建立等提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1材料試驗(yàn)用寬體金線蛭采自全國各地養(yǎng)殖地或者中藥材市場，采集樣品信息見表1。經(jīng)江蘇鹽城工學(xué)院劉飛博士鑒定為黃蛭科金線蛭屬Whitmaniapigra樣品。

表1　寬體金線蛭樣品收集和油酸含量Table 1　Oleic acid content of Whitmania pigra samples from different sources

1.2儀器與試劑Agilent 6890N型氣相色譜儀［帶氫火焰離子檢測器（FID）］（美國Agilent公司）；甲醇（色譜純，德國CNW Technologies公司，批號(hào)：40033024000）；正庚烷（色譜純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號(hào)：2014041301）；三氟化硼（色譜純，中國阿拉丁公司，批號(hào)：B104431）；乙腈（分析純，成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)：2014102201）；氯化鈉（分析純，西隴化工股份有限公司，批號(hào)：141111）。

1.3色譜條件色譜分析柱：DB-WAX（30 mm× 0.32 mm×0.25 μm）；載氣為氮?dú)?0 kPa，氫氣為30 kPa，空氣為400 kPa；氣化室溫度為270℃；檢測器（FID）溫度為 280℃，升溫程序：柱溫130℃，保持5 min，以3℃/min速率升至230℃，保持10 min。

1.4對(duì)照品溶液制備自制現(xiàn)榨花生油提取油酸成分作為對(duì)照品。取600 mg加體積分?jǐn)?shù)15%三氟化硼甲醇溶液甲脂化，30 mL正庚烷萃取，取1 μL溶液注入氣相色譜儀，測定并記錄色譜圖，采樣時(shí)間40 min。對(duì)照品圖譜見圖1。

圖1　對(duì)照品氣相色譜指紋圖譜Figure 1　Gas chromatographic fingerprints of the control of oleic acid

1.5供試品溶液制備稱取干樣品5.0 g，按GB/ T22223-2008處理脂肪，加三氟化硼溶液脂化，30 mL正庚烷萃取，取1 μL溶液上機(jī)，注入氣相色譜儀，測定并記錄色譜圖，采樣時(shí)間為40 min。

1.6方法學(xué)考察

1.6.1穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取樣品編號(hào)為S2供試品溶液，分別在0、4、8、12、24、36、48 h不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測，計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果表明各峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（sR）分別低于4.1%。

1.6.2精密度實(shí)驗(yàn)取樣品編號(hào)為S9供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果表明各峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的sR均低于4.5%。

1.6.3重復(fù)性試驗(yàn)取樣品編號(hào)為S10供試品溶液，同法檢測，計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果表明各峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰的sR均低于5.0%，表明其重復(fù)性良好。

1.7數(shù)據(jù)處理

1.7.1統(tǒng)計(jì)方法為了探討不同規(guī)格的樣品間的油酸含量的差異，本研究采用單因素方差進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所用統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS 19.0。

1.7.2相似度計(jì)算本研究采用中國藥典委員會(huì)推薦的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A》軟件計(jì)算10批寬體金線蛭樣品的指紋圖譜與它們對(duì)照圖譜（對(duì)照圖譜的建立采用中位數(shù)法）的相似度。

2　結(jié)果

2.1寬體金線蛭的油酸含量特點(diǎn)從表1可見，油酸含量最高的是湖北恩威的清水曬干品，為0.84 mg/g，而最低的是廣西荔浦藥材市場的干品，僅0.12 mg/g。不同規(guī)格間的寬體金線蛭的油酸含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F2，7=7.350，P=0.019），其中規(guī)格為礬品和飲片/曬干的油酸含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.924），規(guī)格為清水曬干品分別與礬品、飲片/曬干的油酸含量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.021，P=0.009）。

2.2色譜圖及共有峰的標(biāo)定用建立的色譜條件，對(duì)10批樣品進(jìn)行測定，得到寬體金線蛭油酸指紋圖譜（見圖2）。對(duì)上述油酸色譜圖譜進(jìn)行歸屬，并生成對(duì)照用特征圖譜（見圖3）。

比較分析10批樣品的色譜圖，以圖1作為參照譜，進(jìn)行自動(dòng)匹配［11］。通過《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A》軟件生成一個(gè)10批藥材的中位值的圖譜作為對(duì)照用特征圖譜，以此作為藥材的對(duì)照用特征圖譜（見圖3）。其中以保留時(shí)間為16.461 min的色譜峰被指定為基準(zhǔn)峰，計(jì)算各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積（見表2）。相對(duì)保留時(shí)間的sR值為0.03%～0.28%，但相對(duì)峰面積差別很大，sR值為4.25%～45.50%。

圖2　10批寬體金線蛭油酸氣相色譜指紋圖譜重疊圖Figure 2　Gas chromatographic fingerprints of ten batches of Whitmania pigra samples

圖3　寬體金線蛭油酸氣相對(duì)照色譜指紋圖譜Figure 3　Gas chromatographic contrast fingerprint of Whitmania pigra

表2　10批樣品的保留時(shí)間和峰面積Table 2　Results of retention time and common peaks of ten batches of the samples　sR/%

2.3相似度計(jì)算利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A》，對(duì)10批樣品指紋圖譜進(jìn)行自動(dòng)匹配，相似度計(jì)算結(jié)果在0.458～0.998之間（見表3）。其中，8號(hào)樣品與對(duì)照指紋圖譜的相似度為0.458，低于其他樣品與對(duì)照指紋圖譜的相似度。可見10批樣品中除了8號(hào)和10號(hào)樣品外，其他樣品指紋圖譜相似度高。

表3　10批寬體金線蛭油酸相似度計(jì)算結(jié)果Table 3　Similarity of ten batches of Whitmania pigra samples

3　討論

從指紋圖譜中可以看出，不同來源地的10批寬體金線蛭油酸氣相色譜指紋圖譜中雖然出現(xiàn)了相應(yīng)的色譜峰，但是峰面積比值有所不同，這表明不同來源地之間因成分相對(duì)含量不同所表現(xiàn)出的質(zhì)量水平也不同。這也可以從不同規(guī)格的油酸含量呈顯著性差異得到證實(shí)。油酸含量的高低可能除了與寬體金線蛭的生活環(huán)境有關(guān)，還可能跟炮制方法不同有關(guān)系。鮮品寬體金線蛭中的油酸含量最高，原因可能是礬品、長期放置、高溫燙死等處理會(huì)導(dǎo)致油酸容易揮發(fā)。因此，中藥制劑中需要注意原藥材產(chǎn)地的來源，并確保提取工藝技術(shù)相同，才可能保證中藥制劑質(zhì)量的穩(wěn)定可控。

10批樣品的指紋圖譜分析結(jié)果可以看出色譜峰的保留時(shí)間匹配較好，sR均小于0.28%，符合指紋圖譜研究技術(shù)要求。從峰的匹配結(jié)果來看，主要色譜峰均能找到，然而共有峰的相對(duì)峰面積sR值間差異很大，表明不同來源的寬體金線蛭的共有成分含量懸殊，這可能與養(yǎng)殖方法、養(yǎng)殖環(huán)境、炮制方法有關(guān)［12］。

不同批次的指紋圖譜相似度高，表明不同來源地的水蛭含有化學(xué)成分基本一致。然而，與其他樣品和對(duì)照指紋圖譜相似度比較，來源于廣西荔浦的樣品（8號(hào)）的相似度為最低（0.458），這可能是由于其油酸的含量（0.12 mg/g）為最低而導(dǎo)致。因此，從某種程度上來說，這表明了本研究所建立的色譜指紋圖譜條件能夠有效地區(qū)分寬體金線蛭的優(yōu)劣品，可作為日常質(zhì)量控制的方法，為制定標(biāo)準(zhǔn)提供一定的參考。

［1］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

［2］鄢丹，李果.反相高效液相色譜法直接測定水蛭中14種未衍生氨基酸的含量［J］.分析化學(xué)，2006，34（5）：705.

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［5］劉君，楊松松，欒淑華.對(duì)不同食性的水蛭藥效價(jià)值的探討［J］.中醫(yī)藥學(xué)刊，2005，23（4）：705.

［6］楊潼.螞蟥的醫(yī)藥學(xué)意義［J］.生物學(xué)通報(bào)，1996，31（3）：46.

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【責(zé)任編輯：黃玲】

Gas Chromatographic Fingerprint of Oleic Acid of Whitmania pigra Whitman

HUANG Yong1，ZUO Zhili2，YANG Yilin3，ZHANG Yueyun1，WEI Fan1，ZHAO Chengjian1，MIAO Jianhua1
（1.Medicinal Plants Botanical Garden of the Guangxi Zhuang Autonomous Region，Nanning 530023 Guangxi，China；2.Chengdu Zoo，Chengdu 610081 Sichuan，China；3.Analytical and Testing Center of the Guangxi Zhuang
Autonomous Region，Nanning 530022 Guangxi，China）

ObjectiveTo establish the gas chromatographic（GC）fingerprint of oleic acid of Whitmania pigra Whitman for its quality control.Methods Ten batches of Whitmania pigra from different sources and processed by different methods were analyzed with Agilent 6890N gas chromatography detector on DB-WAX（30 mm×0.32 mm×0.25 μm）column at the vaporizing temperature of 270℃，column temperature of 130℃and flame ionization detector（FID）temperature of 280℃.We used a software of Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM（Version of 2004A）published by Chinese Pharmacopoeia Commission to calculate GC similarity.Results Oleic acid content of Whitmania pigra processed by different methods had significant differences（F2，7=7.350，P=0.019）.The oleic acid content of samples dried after washing with clean water significantly differed from that of the samples processed by alumen or the slices dried naturally（P=0.021，P =0.009）.The similarity of the fingerprints was in the range of 0.458-0.998.The similarity of samples from Lipu of Guangxi Province was the lowest.Conclusion The fingerprints of most of the samples have very high similarity.The established GC fingerprints can be used to effectively identify the qualified or inferior Whitmania pigra products，which will provide some reference for the quality control of Whitmania pigra.

Hirudo；gas chromatography；fingerprints

R284.1

A

1007-3213（2016）05-0716-04

10．13359/j．cnki．gzxbtcm．2016．05．022

2016-01-14

黃勇（1982-），男，博士研究生，副研究員；E-mail:huangykiz@163.com

繆劍華（1962-），男，博士研究生，研究員；E-mail:mjh1962@vip.163.com

現(xiàn)代中藥高技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(xiàng)（編號(hào):發(fā)改辦高技［2011］51號(hào)）；廣西衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)中醫(yī)藥科技專項(xiàng)（編號(hào):GZMZ1215）；南寧市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃（編號(hào):20162102）