黃芪甲苷提取方法優化

李煥娟， 張 聰， 郝 潔

(國家獸用藥品工程技術研究中心/洛陽惠中獸藥有限公司，河南洛陽 471000)

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黃芪甲苷提取方法優化

李煥娟， 張 聰， 郝 潔

(國家獸用藥品工程技術研究中心/洛陽惠中獸藥有限公司，河南洛陽 471000)

[目的]優化黃芪藥材中黃芪甲苷提取方法。[方法]采用單因素試驗對提取方式、提取溶劑、提取次數進行考察，采用HPLC-ELSD法測定黃芪甲苷含量。[結果]黃芪藥材中黃芪甲苷最優提取方法為每次用50倍的50%甲醇加熱回流提取2次，每次1 h。[結論]該試驗所建立的方法操作簡單、準確可靠、重現性好，為黃芪飲片及制劑中黃芪甲苷的提取及含量測定提供參考。

黃芪；黃芪甲苷；提取方法；優化

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge. var.mongholicus(Bge.) Hsiao或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.的干燥根[1]。黃芪甲苷是黃芪藥材及其制劑質量控制的重要指標[2]。研究發現，黃芪藥材中以原形形式存在的黃芪甲苷含量很低，在對其進行制劑研究時，以黃芪甲苷為母核的皂苷類成分極易轉化成黃芪甲苷[3]。另外，由于藥材的處理方法不同，所測得的黃芪甲苷含量也有很大的不同。《中國藥典》2010年版所用樣品前處理方法耗時較長，測得含量偏低[4]。一些學者對黃芪中黃芪甲苷的提取方法進行了研究，但結果仍不太理想[5-7]。該研究采用單因素試驗對提取方式、提取溶劑、提取次數進行考察，優化黃芪藥材中黃芪甲苷提取方法，并采用HPLC-ELSD法測定黃芪甲苷含量，為黃芪藥材及制劑中黃芪甲苷的檢測提供科學依據。

1　 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器。Waters高效液相色譜儀(型號Alliance e2695)、蒸發光散射檢測器(型號2424)，美國沃特世公司；Kromasil 100-5C18柱(5 μm，4.6 mm×150 mm)，瑞典NOBEL公司；AB265-S型電子分析天平，瑞士梅特勒托利多公司；HH-WO型智能數顯多功能水浴鍋、SHZ-D(Ⅲ)型循環水式真空泵，鞏義予華儀器有限責任公司；JK-3200B型超聲清洗器，合肥金尼克機械制造有限公司；TQ-2000Y型高速多功能粉碎機，永康市天祺盛世工貿有限公司。

1.1.2試藥。3批黃芪飲片，購自洛陽康鑫中藥飲片有限公司，產地及批號分別為山西20140421、河北20140912、山西20150416；黃芪甲苷對照品(批號110781-200613，含量100%)，中國食品藥品檢定研究院；正丁醇(AR，批號20140916)、甲醇(AR，批號20150605)，天津富宇精細化學品有限公司；氨水(AR，批號20140306)，煙臺市雙雙化工有限公司；乙腈(色譜純，批號151124)，天津市四友精細化學品有限公司；水為純化水和超純水，自制。

1.2方法

1.2.1對照品溶液的制備。精密稱取黃芪甲苷10.79 mg，置25 mL量瓶，甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

1.2.2供試品溶液的制備。

1.2.2.1提取方式考察。

(1)索氏提取。取黃芪中粉約2 g，精密稱定，置索氏提取器中，加100 mL甲醇，加熱回流4 h，提取液減壓回收溶劑至干，殘渣加10 mL水溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次40 mL，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2次，每次40 mL，棄去洗液，正丁醇液蒸干，殘渣用適量甲醇溶解，轉移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得[1]。

(2)回流提取。取黃芪中粉約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加100 mL甲醇加熱回流1 h，抽濾，濾渣和濾餅加入100 mL甲醇加熱回流1 h，共提取2次，合并濾液，減壓回收溶劑至干，殘渣加10 mL水溶解，其余步驟同“1.2.2.1”中索氏提取。

(3)超聲提取。取黃芪中粉約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加100 mL甲醇超聲1 h，抽濾，濾渣和濾餅加入100 mL甲醇超聲1 h，共提取2次，合并濾液，減壓回收溶劑至干，殘渣加10 mL水溶解，其余步驟同“1.2.2.1”中索氏提取。

1.2.2.2提取溶劑考察。取黃芪中粉約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別加100 mL甲醇、100 mL水、100 mL 50%甲醇加熱回流1 h，抽濾，濾渣和濾餅分別加100 mL甲醇、100 mL水、100 mL 50%甲醇加熱回流1 h，共提取2次，合并濾液，減壓回收溶劑至干，殘渣加10 mL水溶解，其余步驟同“1.2.2.1”中索氏提取。

1.2.2.3提取次數考察。取黃芪中粉約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加100 mL 50%甲醇，加熱回流1 h，每個樣品分別共提取1、2、3次，抽濾，分別合并濾液，減壓回收溶劑至干，殘渣加10 mL水溶解，其余步驟同“1.2.2.1”中索氏提取。

1.2.2.4供試品溶液的制備。取黃芪中粉2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加100 mL 最優溶劑采用最優提取方式提取1 h，抽濾，濾渣和濾餅加入100 mL 最優溶劑采用最優提取方式提取1 h，共提取最優次數，合并濾液，減壓回收溶劑至干，殘渣加10 mL水溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次40 mL，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2次，每次40 mL，棄去洗液，正丁醇液蒸干，殘渣用適量甲醇溶解，轉移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

1.2.3色譜分析條件。色譜柱為Kromasil 100-5C18柱(5 μm，4.6 mm×150 mm)，流動相為乙腈-水(35∶65)，柱溫30 ℃，Waters 2424 ELSD檢測條件，增益50 LSU，漂移管溫度60 ℃，氮氣壓力25 Psi，霧化器溫度36 ℃。

1.2.4方法學考察。

1.2.4.1線性關系的考察。分別精密吸取黃芪甲苷對照品溶液3、5、8、10和15 μL注入液相色譜儀，以對照品峰面積對數(y)為縱坐標、進樣量對數(x)為橫坐標繪制標準曲線，計算得回歸方程。

1.2.4.2 精密度試驗。按“1.2.2”方法制備供試品溶液，連續進樣6次，每次進樣10 μL，測得黃芪甲苷峰面積，計算RSD值，要求該值小于3%。

1.2.4.3 穩定性試驗。取“1.2.2”方法制備供試品溶液，于室溫下放置，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣，每次進樣10 μL，測得黃芪甲苷峰面積，計算RSD值，要求該值小于3%。

1.2.4.4重復性試驗。取同一黃芪中粉2 g，按“1.2.2”方法平行制備供試品溶液6份，每次進樣10 μL，測得黃芪甲苷含量，計算RSD值，要求該值小于3%。

1.2.4.5加樣回收率試驗。取已知含量的同一黃芪中粉1 g，精密稱定，加入黃芪甲苷對照品溶液(0.431 6 mg/mL)5 mL，平行6份，按“1.2.2”方法制備供試品溶液，進樣10 μL，測得黃芪甲苷含量，計算加樣回收率和RSD。

1.2.5樣品含量測定。取市售3批黃芪藥材樣品，按“1.2.2”方法制備供試品溶液，按照“1.2.3”色譜分析條件，測定黃芪甲苷的峰面積，計算含量。

2　 結果與分析

2.1供試品溶液的制備方法按“1.2.2.1”方法操作，結果顯示，索氏提取、回流提取和超聲提取測得黃芪甲苷含量分別為0.178%、0.180%和0.159%，表明回流提取所得黃芪甲苷含量較高。按“1.2.2.2”方法操作，100 mL甲醇、100 mL水和100 mL 50%甲醇作為溶劑進行加熱回流提取，測得黃芪甲苷含量分別為0.179%、0.203%和0.236%，表明提取溶劑為50%甲醇時所得黃芪甲苷含量較高。按“1.2.2.3”方法操作，結果顯示，提取次數分別為1、2和3次所測得黃芪甲苷含量分別為0.197%、0.242%和0.235%，表明提取2次即可將黃芪中的黃芪甲苷提取完全。由此可見，黃芪藥材中黃芪甲苷最優提取方法為每次用50倍的50%甲醇加熱回流提取2次，每次1 h。

2.2色譜條件及系統適應性試驗從圖1可以看出，在相同的色譜條件下，供試品與對照品在相同的保留時間(7.7 min)出峰，且分離度較大，說明此條件適合該樣品測定黃芪甲苷。

圖1　供試品溶液(a)和對照品溶液(b)的HPLC圖譜Fig. 1　HPLC of tested solution (a) and reference solution (b)

2.3方法學考察

2.3.1線性關系的考察。以對照品峰面積對數(y)為縱坐標、進樣量對數(x)為橫坐標繪制標準曲線，計算得回歸方程為Y=1.571 9x+5.407 9(r=0.999 5)，表明黃芪甲苷進樣量在1.26～6.31 μg范圍內進樣量對數與峰面積對數呈良好的線性關系。

2.3.2精密度試驗。按“1.2.4.2”方法操作，計算得峰面積的RSD為1.3%，表明精密度良好。

2.3.3穩定性試驗。按“1.2.4.3”方法操作，計算得峰面積的RSD為2.0%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.3.4重復性試驗。按“1.2.4.4”方法操作，計算得平均含量為0.242%，RSD為2.1%，表明重復性良好。

2.3.5加樣回收率試驗。由表1可見，平均回收率為99.4%，RSD為2.2%，表明該方法準確、可靠，可用于黃芪藥材中黃芪甲苷的含量測定。

表1　加樣回收率試驗結果

2.4樣品含量測定方法確定并驗證后，取市售3批黃芪藥材樣品進行藥材中的黃芪甲苷含量測定。由表2可見，3批黃芪藥材中黃芪甲苷含量分別為0.242%、0.118%和0.209%，其含量均遠大于《中國藥典》2010年版中黃芪藥材中的黃芪甲苷含量標準(0.040%)。

表2　3批樣品含量測定結果(n=3)

3　小結

(1)通過對提取方式、提取溶劑、提取次數3個因素進行考察，黃芪藥材中黃芪甲苷最優提取方法為每次用50倍的50%甲醇加熱回流提取2次，每次1 h。

(2)與《中國藥典》2010年版相比，改進后的方法，簡化了樣品的制備過程，簡便、省時，可作為黃芪藥材及其制劑中黃芪甲苷的檢測方法。該試驗采用的方法測得黃芪甲苷的含量高于藥典方法，若以此法測定黃芪中黃芪甲苷的含量，其含量限度的制訂尚待進一步深入研究。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].北京:中國醫藥科技出版社, 2010:283-284.

[2] 段立軍,孫博航.黃芪甲苷的研究進展[J].沈陽藥科大學學報,2011,28 (5):410-416.

[3] 王春怡,葉雪蘭,李衛民,等.黃芪總皂苷提取物的質量標準研究[J].時珍國醫國藥, 2012,23(1):94-96.

[4] 潘細貴,汪洋,雷湘,等.大孔吸附樹脂純化黃芪總皂昔的提取工藝研究[J].中國醫院藥學雜志, 2005,25(11):1029-1030.

[5] 劉浩文,劉嘉儀,楊妙榮,等.黃芪藥材中黃芪甲苷含量測定的兩種方法的比較研究[J].中藥新藥與臨床藥理,2011,22(6):659-662.

[6]丁如賢,李霞,李一珺,等.黃芪藥材、飲片中黃芪甲苷含量測定方法的改進[J].世界中醫藥,2013,8(6):669-671.

[7] 姜麗麗,張傳領,蘇麗娟,等.HPLC-UV法測定黃芪干燥根中黃芪甲苷的含量[J].安徽農業科學,2014,42(22):7381-7383.

Improvement in Extraction Method of Astragaloside IV

LI Huan-juan, ZHANG Cong, HAO Jie

(National Research Center for Veterinary Medicine / Luoyang Huizhong Animal Medicine Co. , Ltd., Luoyang, Henan 471000)

[Objective] The aim was to improve the extraction method of astragaloside IV from Astragali Radix. [Method] Three factors including extraction method, extraction solvent and extraction times were studied through single-factor test. HPLC-ELSD method was adopted to analyze the determination results of astragaloside IV. [Result] The best extraction method of astragaloside IV in Astragali Radix was as follows: 50 times of 50% methanol was added, heated reflux extraction was adopted for two times with 1 hours for each extraction. [Conclusion] The improved method is simple, accurate and reproducible, which can supply a reference for extraction and determination of Astragali Radix.

Astragali Radix; Astragaloside IV; Extraction method; Optimization

李煥娟(1989- )，女，河南平頂山人，碩士，從事中藥制劑工藝研究。

2016-06-24

S 567

A

0517-6611(2016)22-125-03