酶解法制備鰈魚骨蛋白胨及其細菌培養試驗

欒君笑，劉志昌，佟長青，曲 敏，李 偉，金 橋

(遼寧省水產品加工及綜合利用重點開放實驗室，大連海洋大學食品科學與工程學院，遼寧大連 116023)

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酶解法制備鰈魚骨蛋白胨及其細菌培養試驗

欒君笑，劉志昌，佟長青，曲 敏，李 偉，金 橋*

(遼寧省水產品加工及綜合利用重點開放實驗室，大連海洋大學食品科學與工程學院，遼寧大連 116023)

[目的] 研究鰈魚骨蛋白胨的制備工藝并對其在細菌培養中的應用進行了初步探討。[方法] 采用乙酸和胃蛋白酶提取鰈魚骨蛋白胨，以蛋白提取率為指標，在單因素試驗基礎上，采用正交試驗優化制備工藝，并對鰈魚骨蛋白胨作為氮源在細菌培養中的應用進行了研究。[結果] 鰈魚骨蛋白胨提取的最佳工藝條件為：提取時間20 h、提取溫度40 ℃、料液比1∶50 g/mL、胃蛋白酶加酶量3 000 U/g，在此條件下鰈魚骨蛋白胨的提取率為55.62%。蛋白胨產品的氨基酸種類齊全。通過細菌培養試驗發現，對于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌，鰈魚骨蛋白胨的培養效果與市售細菌學蛋白胨相似。[結論] 鰈魚骨蛋白胨能夠提供細菌生長所需要的氮源營養，可作為氮源應用于細菌的培養。

鰈魚骨；蛋白胨；氨基酸組成；細菌培養

魚類在加工過程中，會產生大量下腳料(包括魚頭、魚骨、魚皮、魚鱗、魚鰭及內臟等)，其質量約占原料魚的40%～55%[1]，魚骨是魚的主要副產物，約占魚體重的15%[2]。目前，發達國家的水產品加工率在80%以上，而我國的水產品加工率距離這一水平仍有差距[3]。魚加工下腳料中含有豐富的蛋白質、磷脂質、軟骨素、維生素等[4]，這些營養物質和有用成分是重要的生物資源，但目前這些下腳料主要用來生產魚貯飼料、魚粉等，對其中有價值的成分尚未充分利用。如何深度開發魚下腳料的利用途徑，對水產品加工綜合利用和保護環境有重要的意義，也能支持和促進我國水產行業的健康發展。

魚類下腳料加工的綜合利用是近年的研究熱點，其中利用酶法水解下腳料提取蛋白物，是下腳料的高值化利用的主要途徑之一[5]。蛋白胨是可溶于水、具有加熱不凝固特性的蛋白水解物[6]，可為微生物的生命代謝提供氮源營養，是許多微生物培養基的重要組分。蛋白胨的生產常用酸水解、堿水解和酶水解等方法，其中酶解法因具有操作簡單、產品質量穩定等優點而逐漸取代了酸堿等化學方法。但酶解法生產蛋白胨普遍存在產品提取率低、酶成本高等不足，因此，研究新的蛋白胨生產工藝對降低生產成本、提高產品的提取率具有重要的意義。

自從1949年，Tarr等首次將魚蛋白胨用于細菌培養以來[7]，不少學者對水產蛋白質的酶解產物(外源蛋白酶水解或內源蛋白酶自溶)作為氮源營養應用于微生物培養進行了研究[8-12]，但目前少見利用酶解鰈魚魚骨制備蛋白胨的報道。筆者采用低濃度的乙酸與胃蛋白酶結合的方法，對影響酶解過程的各因素進行了研究，確定了鰈魚骨酶解制備蛋白胨的最佳提取工藝條件，對蛋白胨產品的氨基酸組成進行了檢測，并對其作為氮源營養在細菌培養上的應用進行了初步探討。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1原料。鰈魚骨，黃金鰈魚(LimandaAspera)中翅骨取自大連美漁坊食品有限公司，放置于冰柜中冷凍保存。

1.1.2主要試劑。胃蛋白酶(1∶3 000)，Amresco公司；氨基酸標準品(A9781-5 mL)、PITC(P1034-1 mL)，西格瑪；市售細菌學蛋白胨及胰蛋白胨，北京奧博星生物技術有限公司；乙酸、氯化鈉、碳酸鈉、氫氧化鈉、硫酸銅、酒石酸鉀、硫酸鋰、甲醇、乙腈、濃鹽酸、無水乙酸鈉、冰醋酸等，均為分析純。

1.1.3供試菌種及培養基。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，均由大連海洋大學食品科學與工程學院微生物實驗室保存；營養肉湯培養基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉5.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.4。

1.1.4主要儀器。BS110 S分析天平，北京賽多利斯儀器系統有限公司；UV-1750紫外分光光度計，島津儀器(蘇州)有限公司；HH-A數顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；FW100干式粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司；HG202-1A烘箱，南京實驗儀器廠；SD-1500噴霧干燥機，上海沃迪自動化裝備股份有限公司；LC-20A高效液相色譜儀，島津；HH.B11.420-BS恒溫培養箱，上海躍進醫療器械廠。

1.2方法凍魚骨經解凍，蒸餾水清洗后烘箱50 ℃烘至恒重，干魚骨絞碎成小片，使用干式粉碎機研磨成粉末待用。

1.2.1胃蛋白酶添加量的選擇。稱取10 g鰈魚魚骨，加入30倍體積的0.5 mol/L乙酸溶液，在37 ℃條件下分別加入1 000、1 500、2 000、2 500、3 000、3 500 U/g胃蛋白酶，水解24 h后在沸水浴滅酶。采用福林-酚法[13]測定蛋白提取率，確定最適酶添加量。

1.2.2酶解溫度的選擇。稱取10 g鰈魚魚骨，加入30倍體積的0.5 mol/L乙酸溶液及胃蛋白酶(2 500 U/g)，分別在25、30、35、40、45、50 ℃條件下水解24 h，滅酶，測定蛋白提取率，確定最適酶解溫度。

1.2.3酶解時間的選擇。稱取10 g鰈魚魚骨，加入30倍體積的0.5 mol/L乙酸溶液及胃蛋白酶(2 500 U/g)，40 ℃條件下分別水解4、8、12、16、20、24、28、32 h，滅酶，測定蛋白提取率，確定最適酶解時間。

1.2.4料液比的選擇。稱取10 g鰈魚魚骨，加入料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g/mL的0.5 mol/L乙酸溶液及胃蛋白酶(2 500 U/g)，40 ℃條件下水解24 h，滅酶，測定蛋白提取率，確定最適料液比。

1.2.5乙酸濃度的選擇。稱取10 g鰈魚魚骨，加入30倍體積濃度為0.1～0.6 mol/L乙酸溶液及胃蛋白酶(2 500 U/g)，40 ℃條件下分別水解24 h，滅酶，測定蛋白提取率，確定最適乙酸濃度。

1.2.6酶解最優工藝條件的確定。根據單因素試驗結果，采用福林-酚法測定蛋白提取率作為考察指標，對水解條件進行優化，以胃蛋白酶添加量、酶解時間、酶解溫度、料液比進行4因素3水平正交試驗，確定酶解的最佳工藝，因素水平表見表1，按L9(34)正交表進行正交試驗。根據最優工藝條件制備蛋白胨酶解液，然后噴霧干燥制備蛋白胨產品，噴霧干燥機進風設定為180 ℃，出風設定90 ℃，風機速度設定為50 Hz，蠕動泵轉速設定為800 mL/h，噴霧壓力設定為4.1×105Pa。

表1　正交試驗因素水平

1.2.7蛋白胨產品氨基酸組成分析。利用異硫氰酸苯酯(PITC)柱前衍生化RP-HPLC法[14]測定鰈魚骨蛋白胨產品的氨基酸組成。

1.2.8細菌生長試驗。將活化好的細菌接種到營養肉湯培養基中，每隔一定時間測定OD600，以培養時間為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制微生物生長曲線[15]。

2　結果與分析

2.1單因素試驗結果由圖1可見，隨著胃蛋白酶添加量的增加，鰈魚骨蛋白的提取率呈上升趨勢，但當胃蛋白酶用量超過2 500 U/g時，增加酶用量蛋白提取率增加緩慢，3 000 U/g為提取率最高的酶用量。因此，初步選定3 000 U/g為最佳酶量。

圖1　不同酶添加量對蛋白胨提取率的影響Fig.1　Effects of different pepsin concentrations on extraction of peptone

如圖2所示，蛋白提取率隨溫度上升緩慢增加，最高點為提取溫度45 ℃，超過該溫度后蛋白提取率下降。

圖2　不同酶解溫度對蛋白胨提取率的影響Fig.2　Effects of different hydrolysis temperature on extraction of peptone

如圖3可知，24 h以內隨著提取時間的增加，蛋白提取率增長較快，超過24 h增長不明顯。因此，初步選定24 h為最佳提取時間。

圖3　不同酶解時間對蛋白胨提取率的影響Fig.3　Effects of different hydrolysis time on extraction of peptone

如圖4所示，料液比在1∶10～1∶60 g/mL時，隨著提取介質的增加，提取率不斷增加，但當料液比達到1∶40 g/mL后，提取率幾乎不變。考慮到液體體積過大會給后期分離純化帶來不便，因此料液比定為1∶40 g/mL較為合適。

圖4　不同料液比對蛋白胨提取率的影響Fig.4　Effects of different solid-liquid ratio on extraction of peptone

如圖5所示，當乙酸濃度為0.4 mol/L時，提取率最高。因此，初步選定0.4 mol/L乙酸為最適乙酸濃度。

圖5　不同乙酸濃度對蛋白胨提取率的影響Fig.5　Effects of different acetic acid concentration on extraction of peptone

2.2正交試驗結果在單因素試驗基礎上，以蛋白提取率為指標采用正交試驗對提取工藝進行優化，試驗結果見表2。

由極差分析(R值)可知，4個因素對鰈魚骨蛋白提取率的影響大小依次為D、C、A、B，即料液比、酶解溫度、加酶量、酶解時間；優化所得條件為A2B1C1D3，即加酶量3 000 U/g、酶解時間20 h、酶解溫度40 ℃、料液比1∶50 g/mL，在此條件下鰈魚骨蛋白胨的提取率為55.62%。

2.3鰈魚骨蛋白胨的氨基酸組成鰈魚骨蛋白胨產品的氨基酸種類較為齊全，谷氨酸和甘氨酸含量較多，分別為13.48%和14.71%，其余氨基酸含量在1.21%～9.34%，其中組氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸含量較低。除色氨酸未測得外，其余7種必需氨基酸均含有，總含量占總氨基酸的28.17%。

表2　正交試驗的結果與分析

2.4細菌生長試驗結果金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)在3種測試培養基中的生長情況如圖6～8所示。

圖6　不同培養基中金黃色葡萄球菌的生長曲線Fig.6　The growth curve of Staphylococcus aureus by different medium

圖7　不同培養基中大腸桿菌的生長曲線Fig.7　The growth curve of Escherichia coli by different medium

圖8　不同培養基中枯草芽孢桿菌的生長曲線Fig.8　The growth curve of Bacillus subtilis by different medium

3種細菌在各測試培養基中的生長趨勢相似，在試驗中沒有觀察到生長延滯期，細菌從接入培養基后即進入指數生長期，隨后是生長穩定期。金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的生長最高點出現在培養24 h，而枯草芽孢桿菌的生長峰值出現在培養36 h左右。3種細菌均在含有市售細菌學蛋白胨的培養基中生長最佳，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌在含鰈魚骨蛋白胨培養基中的生長優于含有市售胰蛋白胨的培養基，而枯草芽孢桿菌在市售胰蛋白胨培養基中的生長優于含鰈魚骨蛋白胨培養基。3種細菌在含有市售細菌學蛋白胨或鰈魚骨蛋白胨的培養基中生長特征并沒有較大差異，這證明鰈魚骨蛋白胨能夠提供細菌生長所需要的氮源營養。

魚類加工產生的下腳料中，魚頭、魚骨等含有豐富的鈣質，并且還黏連著不少魚肉，是較好的蛋白質資源。Vecht-Lifishitz等報道了魚蛋白胨用于培養大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，其生長速率優于細菌蛋白胨(bactopeptone，Difco公司)[8]。Dufosse等將提取自鱈魚、鮭魚、雜魚的蛋白胨應用于細菌、酵母菌、霉菌的培養，并與酪蛋白胨的培養效果進行比較，發現魚蛋白胨的培養效果優于酪蛋白胨[9]。Vieira等利用蛋白酶將水產加工副產物水解制備蛋白胨并用于大腸桿菌的培養，結果表明4種由魚蝦加工副產物制備得到的蛋白胨，其細菌生長速率和穩定期OD550值均高于市售蛋白胨(Oxoid)[10]。Aspmo等的研究顯示，大西洋鱈魚內臟經過不同條件的蛋白酶水解后制備的蛋白胨可替換市售蛋白胨用于微生物的培養[11]。萬菡等利用蛋白酶水解草魚內臟并用于微生物的培養，優選出最適微生物培養基的草魚內臟水解蛋白[12]。綜上所述，酶解魚類加工下腳料提取制備的蛋白胨產品，可作為細菌培養基中氮源營養的潛在來源。

3　結論

該試驗結果表明，鰈魚魚骨中含有豐富的蛋白質，最佳

提取條件加酶量3 000 U/g，酶解時間20 h，酶解溫度40 ℃，料液比1∶50 g/mL，此條件下鰈魚骨蛋白胨的最大提取率可達55.62%。鰈魚骨蛋白胨產品的氨基酸種類齊全，能夠滿足供試細菌的生長要求。利用低濃度的乙酸與胃蛋白酶結合的方法，酶解鰈魚魚骨提取蛋白胨，實現了下腳料的高值化利用，可變廢為寶，提高水產品的附加值，降低主導產品的生產成本，對水產品加工綜合利用和保護環境都有重要的意義。

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Preparation of Peptone from Flatfish Bone Using Pepsin and Bacterial Culture Experiment

LUAN Jun-xiao, LIU Zhi-chang, TONG Chang-qing, JIN Qiao*et al

(Key and Open Laboratory of Aquatic Products Processing and Utilization of Liaoning Province, College of Food Science and Engineering, Dalian Ocean University, Dalian, Liaoning 116023)

[Objective] To optimize technique for extracting peptone from flatfish bone, and discuss its bacterial culture effect. [Method] Pepsin and acetic acid were used to extract peptone from flatfishLimandaaspera. With extraction yield as index, the optimal conditions were determined based on single factor experiment. The bacterial culture effect of peptone as nitrogen source was also studied. [Result] The optimal processing condition was: extraction time 20 hours, extraction temperature 40 ℃, solid to liquid ratio 1∶50 g/mL and 3 000 U/g pepsin, and the yield of peptone reached up to 55.62%. The amino acid composition of flatfish bone peptone was various and rich. Using three common and typical bacteriaStaphylococcusaureus,Escherichiacoli,Bacillussubtilis, the performances of flatfish bone peptone was compared to commercial peptone. Results showed that bacterial culture effect of flatfish bone peptone was similar to commercial peptone. [Conclusion] The study demonstrates that flatfish bone peptone could provide nitrogen nutrients needed for bacterial growth, and could be used as nitrogen source in the cultivation of the bacteria.

Flatfish bone; Peptone; Amino acid composition; Bacterial culture

大連海洋大學科研項目(017214)。

欒君笑(1992-)，男，遼寧大連人，碩士研究生，研究方向：海洋生物資源開發利用。*通訊作者，副教授，博士，碩士生導師，從事海洋生物資源利用研究。

2016-06-03

S 986

A

0517-6611(2016)22-084-04