不同提取方法對荔枝干粗多糖提取率及其自由基清除活性的影響

彭 剛， 陳梓欣， 張曉輝， 黃略略， 張樹飛， 喬 方

(深圳職業技術學院應用化學與生物技術學院，廣東深圳 518055)

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不同提取方法對荔枝干粗多糖提取率及其自由基清除活性的影響

彭 剛， 陳梓欣， 張曉輝， 黃略略， 張樹飛， 喬 方*

(深圳職業技術學院應用化學與生物技術學院，廣東深圳 518055)

[目的]通過比較提取率和抗氧化活性，從3種多糖提取方法中篩選出適合荔枝干多糖的提取方法。[方法]優化熱水浴、微波超聲協同和纖維素酶活法各提取參數條件，比較三者在多糖得率、含量以及對ATBS和DPPH自由基清除方面的差異。[結果]熱水浴法多糖提取率隨溫度升高而逐漸增加，但溫度較高時其升幅降低；微波超聲協同法液料比變化對提取率有影響，但提升幅度較小；纖維素酶活法也存在類似現象。在最優條件下纖維素酶活法具有最低的提取率和最高的多糖比率。另外，纖維素酶提取法所得多糖清除ATBS自由基能力較強，其次為熱水浴法，最后為微波超聲協同法。[結論]熱水浴法具有提取率高、操作簡便、多糖含量和抗氧化活性較高等優勢，更適合于荔枝干多糖的提取。

荔枝干；多糖；抗氧化活性；提取率

荔枝(LitchichinensisSonn)屬于無患子科荔枝屬植物，原產我國，目前在亞洲東南部、非洲、美洲、大洋洲均有廣泛栽培[1]。作為嶺南特色熱帶水果，荔枝在我國已有兩千多年的種植歷史。荔枝鮮果采收期短，且不易保存，常被制成荔枝干，以保證市場周年供應。《本草綱目》記載：“常食荔枝，能補腦健身，治療瘴癘療腫，開胃益脾；干制品能補元氣，為產婦及老弱補品[2]。”研究表明，荔枝干果肉中主要活性成分為多糖，該成分具有降血壓、降血糖、抗疲勞、提高免疫力等功效[3]。

為了更好地研究荔枝干多糖，其成分提取是關鍵的一步。傳統植物多糖提取常采用熱水浴法，該方法具有操作簡便、使用儀器少等特點。但隨著科學技術手段的增加，新的提取工藝也在不斷涌現，如纖維素酶活法、微波超聲協同提取法[4]。這些方法均具有各自的優缺點，但是否適用于荔枝干多糖提取，有待進一步研究。筆者采用3種多糖提取方法提取荔枝干多糖，比較3種方法在多糖提取率、多糖含量以及所提多糖抗氧化活性方面的差異，篩選出適合荔枝干多糖的提取方法，以期為進一步研究荔枝干多糖功能奠定基礎。

1　材料與方法

1.1 材料

1.1.1原料及試劑。荔枝干購于深圳市南山區西麗果場。乙醇、甲醇、濃硫酸、葡萄糖購自廣州化學試劑廠。纖維素酶和抗壞血酸購自廣州健陽生物科技有限公司。考馬斯亮藍G-250、牛血清蛋白標準品、DPPH和ATBS均購自于Sigma公司；試驗所用試劑均為分析純。

1.1.2主要儀器。TM-767專業冰沙攪拌機，DK-20水浴磁力攪拌器，CW-2000超聲微波協同萃取儀，L6紫外-可見分光光度計，5810R高速冷凍離心機，Enspire Xenon Light Module多功能酶標儀，Seven Multi多功能pH計。

1.2方法

1.2.1荔枝干粉制備。將購買的妃子笑荔枝干去除果皮和種子后，稱取500 g放入冰沙攪拌機中，并加入500 mL 80%的乙醇溶液，開機攪拌2 min；將勻漿液倒入已鋪設2層紗布的漏斗中進行過濾，并不斷用鑰匙攪拌以加快過濾過程；待濾液流盡后，再次將濾渣與500 mL 80%的乙醇溶液混合攪拌，過濾，完后再重復1次；所獲得濾渣在50 ℃下烘干，打粉備用。

1.2.2傳統熱水浴提取荔枝干多糖。稱取1 g左右荔枝干粉末，按10∶ 1、20∶1、30∶1的液料比加入純水(pH 7.5)；放入磁力轉子，分別置于60、80和100 ℃的熱水浴中攪拌2 h；待冷卻至室溫后，在4 ℃、10 000 r/min 離心10 min；最后量取上清液，并加入3倍體積的無水乙醇，混勻后4 ℃沉淀過夜，次日離心后，沉淀即為荔枝干粗多糖[5]。多糖提取率公式參照張鐘等[6]的方法。

1.2.3纖維素酶活法提取荔枝干多糖。參考Zhang等[5]的方法并進行調整，具體步驟：稱取1 g荔枝干粉末，并按物料比0.5%、1.0%、1.5%加入相應量的纖維素酶粉，再按10∶1、20∶1、30∶1的比例加入pH 4.8的水溶液；隨后將溶液與粉末混勻后，加入磁力轉子，在50 ℃下水浴反應2 h；最后按照熱水浴法離心、沉淀多糖。1.2.4微波超聲協同法提取荔枝干多糖。稱取1 g荔枝干粉末，按10∶1、20∶1、30∶1的液料比加入純水，裝入特制的超聲瓶中，放入超聲微波協同萃取儀；設置溫度上限為50 ℃，并調整微波功率從100～300 W，反應30 min；完成后，取出反應溶液，離心取上清，其余步驟采用熱水浴法提取和沉淀多糖[5]。1.2.5荔枝干多糖含量測定。參照姜瓊等[7]的苯酚-硫酸法制作葡萄糖標準曲線和測定多糖含量。多糖比率計算公式參照張鐘等[6]的方法。

1.2.6荔枝干粗多糖DPPH抗氧化活性測定。參照Zhang等[8]的方法，以抗壞血酸為標準物。

1.2.7荔枝干粗多糖ATBS抗氧化活性測定。參照Re等[9]的方法，以抗壞血酸為標準物。

2　結果與分析

2.1不同參數條件下傳統熱水浴法對荔枝干多糖提取的影響由表1可知，在一定提取溫度范圍內(60～80 ℃)，隨著溫度的升高，多糖提取率從4.3%升高到10.0%左右。但隨著溫度的進一步升高(80～100 ℃)，多糖提取率則呈平穩或略有降低的趨勢。這表明溫度過高反而抑制荔枝干粗多糖提取率的上升。類似現象在其他材料上均有發現[10-11]。因此，熱水浴最優溫度應在80 ℃左右，而此時荔枝干多糖提取率約為10%。在相同溫度(80 ℃)下，隨著液料比的增加多糖提取率升高。但在高溫條件下(80 ℃以上)，液料比為30∶1～20∶ 1多糖提取率差異不顯著，且提取液的增加反而加大了后續操作難度。因此，液料比一般控制在30∶1和20∶1為宜。在多糖比率方面，無論是溫度還是液料比的改變并未使得多糖比率呈明顯規律性變化，基本維持在37.0%～44.4%。

表1不同條件下熱水浴法對荔枝干粗多糖提取效率的影響

Table 1The effect of different hot-water extraction parameters on dry litchi polysaccharide extraction

提取溫度Extractiontemperature∥℃液料比Liquid-solidratio提取率Extractionrate∥%多糖比率Polysaccharideratio∥%6010∶14.3±0.4643.26020∶16.6±0.4437.46030∶17.8±0.4041.48010∶17.7±0.4240.68020∶19.6±0.5137.08030∶110.1±0.0342.510010∶16.6±0.9644.410020∶18.1±0.7737.810030∶110.2±0.5041.8

2.2不同參數條件下微波超聲協同法對荔枝干多糖提取的影響由表2可知，在微波超聲協同提取荔枝干粗多糖過程中，隨著微波功率的增加，多糖提取率略有降低，但基本保持在8.1%～10.3%。但液料比的增加，總體小幅度提高了多糖提取率。在多糖比率方面，在相同微波功率條件下，隨著液料比中提取液含量的增加，多糖比率呈上升趨勢，基本維持在35.6%～46.3%。而在相同液料比條件下，微波功率變化對多糖比率的影響不存在明顯規律。在相同超聲功率條件下，當微波功率高于200 W時多糖提取率下降[12-13]。另外，在微波功率高于200 W時，隨著液料比的增加，多糖提取率呈小幅上升趨勢。這與關于金針菇方面的試驗結果相近[14]。

表2不同條件下微波超聲協同法對荔枝干粗多糖提取效率的影響

Table 2The effect of different microwave-ultrasounic coordination extraction parameters on dry litchi polysaccharide extraction

微波功率Microwavepower∥W液料比Liquid-solidratio提取率Extractionrate∥%多糖比率Polysaccharideratio∥%10020∶19.0±0.2140.310030∶19.1±0.1742.110040∶18.8±0.3741.320020∶18.1±0.1230.020030∶19.1±0.3535.720040∶19.2±0.1143.230020∶17.5±0.2135.630030∶18.5±0.3338.330040∶110.3±0.1846.3

2.3不同參數條件下纖維素酶活法對荔枝干多糖提取的影響由表3可知，在相同液料比條件下，不同酶用量對荔枝干粗多糖提取率影響不明顯。但在相同酶用量條件下，隨著液料比的增加，多糖提取率從2.5%逐漸升高到4.2%。但在不同條件下，多糖比率基本保持在48%～50%。提取過程中，纖維素酶用量在0.5%～1.5%，多糖比率總體呈上升趨勢，但不同處理之間差異不顯著[15]。而相同酶用量條件下，液料比的改變則使得多糖提取率小幅提升，小于1%。這與纖維素酶法提取金釵石斛多糖結果相近，即液料比對提取率有影響，但提升幅度較小[16]。

表3不同條件下纖維素酶活法對荔枝干粗多糖提取效率的影響

Table 3The effect of different cellulose extraction parameters on dry litchi polysaccharide extraction

酶用量Enzymedosage∥%液料比Liquid-solidratio提取率Extractionrate∥%多糖比率Polysaccharideratio∥%0.510∶12.1±0.2951.00.520∶13.3±0.1746.80.530∶13.3±0.0857.71.010∶12.0±0.3344.31.020∶13.3±0.0948.61.030∶13.2±0.1659.61.510∶12.5±0.0553.61.520∶13.6±0.1051.01.530∶14.2±0.1756.8

2.4不同提取方法所得粗多糖的抗氧化活性差異由圖1可知，作為標準物，維生素C無論對ATBS自由基還是DPPH自由基均具有較強的自由基清除能力，其IC50分別為47.2和23.5 μg/mL。熱水浴法所提粗多糖在清除ATBS和DPPH自由基方面均明顯低于纖維素酶活提取法。在ATBS自由基清除能力方面，熱水浴法所提多糖IC50為214.2 μg/mL；纖維素酶活法IC50為196.7 μg/mL。而清除DPPH自由基時，二者IC50分別為139.2、123.7 μg/mL。但微波超聲協同法所提多糖對不同自由基清除能力存在差異。其對ATBS自由基清除能力較弱(IC50=267.3 μg/mL)，而對DPPH自由基清除能力較強(IC50=100.8 μg/mL)。這可能是由于超聲處理易導致多糖長鏈分子斷裂，從而提高了其對DPPH自由基清除能力[17-18]。

圖1　不同提取方法所得多糖對ATBS(A)和DPPH(B)自由基清除能力Fig.1　The ATBS (A) and DPPH (B) free radical scavenge capacity of polysaccharides from different extraction methods

3　結論與討論

該研究對荔枝干多糖不同提取方法的參數進行優化，結果表明，傳統熱水浴法：提取溫度80 ℃，液料比20∶1，多糖提取率為10%；超聲微波輔助法：功率200 W，液料比30∶1，多糖提取率為9.1%;纖維素酶活法：酶量1.0%，液料30∶1，多糖提取率為3.2%。比較3種方法所得荔枝干粗多糖在DPPH和ATBS自由基清除能力方面的差異，結果表明，微波超聲協同法所得多糖活性較低，熱水浴與纖維素酶活法所得多糖活性相近。綜合考慮多糖提取率和活性指標，傳統熱水浴法更適合荔枝干多糖的提取。

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Effect of Different Extraction Methods on the Extraction Rate and Free Radical Scavenging Capacity of Dry Litchi Crude Polysaccharide

PENG Gang, CHEN Zi-xin, ZHANG Xiao-hui, QIAO Fang*et al

(School of Applied Chemistry and Biological Technology, Shenzhen Polytechnic, Shenzhen, Guangdong 518055)

[Objective] In order to screen an extraction method for dry litchi, three different polysaccharide extraction methods were compared with their extraction rate and antioxidant activity.[Method] The parameters of conventional hot water, microwave-ultrasounic coordination and cellulose methods were optimized to reach optimal yield.Then the crude polysaccharide, polysaccharide content and their DPPH and ATBS scavenging capacity were compared.[Result] In conventional hot water method, the extraction rate was increased with the improvement of temperature.But at the high temperature stage, the increase was limited; in microwave-ultrasonic coordination method, the change ratio of liquid to material also had effect on extraction rate; the similar phenomenon was also found in cellulose method, which had the lowest extraction rate, but the highest polysaccharide rate.The antioxidant activity test showed that the polysaccharide from cellulose extraction method had the strongest ATBS free radical scavenging activity, then the conventional hot water and microwave-ultrasonic coordination method.But a little difference was found in DPPH test, due to the increase activity from microwave-ultrasonic coordination method.[Conclusion] Due to the highest extraction rate, easy operation, higher polysaccharide content and antioxidant activity, the conventional hot water method was fit to dry litchi polysaccharide extraction.

Dry litchi; Polysaccharides; Antioxidant activity; Extraction rate

深圳市科技計劃項目(JCYJ20140508155916427)；現代農業產業技術體系建設專項(CARS-33-20)。

彭剛(1983-)，男，四川宜賓人，助理研究員，博士，從事植物生物活性物質提取及開發方面的研究。*通訊作者，教授，博士，從事食品功能性開發研究。

2016-06-22

S 667.1

A

0517-6611(2016)22-098-03