動態監測微小殘留病對急性白血病預后的臨床意義

吳玉玲，汪福康，汪　瓊，汪　勇，余　超，徐友善，王立鼎，吳晉安，章賽蕪（黃山市人民醫院血液科，安徽245000）

動態監測微小殘留病對急性白血病預后的臨床意義

吳玉玲，汪福康，汪瓊，汪勇，余超，徐友善，王立鼎，吳晉安，章賽蕪△（黃山市人民醫院血液科，安徽245000）

目的探討監測微小殘留病（MRD）在急性白血病（AL）復發預測及指導臨床治療中的意義。方法選取2011年1月至2013年12月該科收治的36例初治AL患者，共采集160份骨髓液及外周血液標本，利用四色多參數流式細胞術（FCM）進行MRD檢測。以CD45/SSC設門，選用2～3組四色抗體組合，從首次誘導化療結束，每1～3個月進行MRD檢測1次，動態監測MRD水平的變化與AL復發之間的相關性。結果按誘導治療第1次結束時的MRD水平分為三組：MRD＞1×10-2組 （22例）、MRD為1×10-4～1×10-2組 （6例）、MRD＜1×10-4組 （8例）。MRD＞1×10-2組復發率［81.8% （18/22）］明顯高于MRD＜1×10-4組［12.5%（1/8）］，差異有統計學意義（P=0.003），而MRD為1×10-4～1×10-2組復發率［50.0% （3/6）］與MRD＜1×10-4組比較，差異無統計學意義（P=0.059）。MRD＜1×10-4預后良好。另30例檢測外周血和骨髓MRD的AL患者中，外周血MRD＞1×10-214例，MRD為1×10-4～1×10-27例，MRD＜1×10-49例；骨髓MRD＞1×10-28例，1×10-4～1× 10-210例，＜1×10-412例。結論AL患者MRD陽性比形態學復發出現時間早，因此，動態監測MRD對AL預測復發和指導個體化治療有重要意義。

腫瘤，殘余；白血病；急性病；預后；流式細胞術

急性白血病（acute luekemia，AL）是一組起源于造血干/祖細胞的惡性克隆性疾病，有高度異質性。隨著現代醫學的發展，AL的診斷和治療水平一直在不斷提高，急性髓系白血病（acutemyeloid luekemia，AML）的完全緩解率可達50%～80%，5年無病生存率可達20%～40%［1］，大多數患者最終會面臨復發，其根源主要是體內殘留的白血病細胞［2］。微小殘留病（minimal residual disease，MRD）是指AL患者經由骨髓移植治療或誘導化療，達到臨床和血液學完全緩解之后，在其體內仍殘存著微量白血病細胞的一種狀態。目前，已有許多報道顯示，多種基因與AL的預后相關，可起到預測預后的作用，如NPM1、FLT3-ITD、CEBPA基因等，某些基因甚至與AL早期復發有關，如IKZF1基因，但這對于基因突變陰性的患者并不適用［3］。因此，在AL臨床緩解期間進行準確定量MRD對有復發風險的患者是至關重要的，而且動態監測MRD對病情有更準確的評估，避免對治療反應好的患者治療過度、對病情兇險的患者治療強度不足。目前監測MRD的主要方法是流式細胞術（FCM）和實時熒光定量聚合酶反應（FQ-PCR）。本研究采用FCM監測MRD，并進行動態觀察以指導臨床治療。

1　資料與方法

1.1一般資料選取2011年1月至2013年12月在本科初治的AL患者36例，其中男20例，女16例；年齡19～75歲；急性髓系白血病（除M3）28例，急性淋巴細胞白血病8例。

1.2主要試劑抗體購自美國BD公司。20種四色熒光（FITC、PE、Perc-CY5.5、APC）標記的主要單抗如下：（1）髓系：CD33、CD117、CD13、CD14、CD15、cMPO、CD11b；（2）T淋巴細胞系：cCD3、CD5、CD7；（3）B淋巴細胞系：CD10、CD19、CD20、CD22、CD23、cCD79a；（4）NK細胞：CD56；（5）非特異性早期標記：CD34、HLA-DR、CD38、CD45。

1.3方法

1.3.1標本采集第1次誘導緩解治療后，抽取患者骨髓標本，涂片6～8張進行骨髓細胞形態學分析，另抽取3～5mL骨髓用肝素抗凝，24 h內進行流式細胞學數據采集，患者定期鞏固化療，每1～3個月進行MRD檢測。其中30例患者在疾病過程中分別至少一次行外周血和骨髓MRD檢測。

1.3.2標本標記利用四色熒光（FITC、PE、Perc-CY5.5、APC）直接標記法標記。依照初次免疫分型而選擇2～3組四色熒光抗體組合，分別放在試管中，試管上標記所加的熒光抗體。每一個試管分別加入待測熒光標記的抗體20μL、骨髓液或外周血細胞懸液100μL，搖勻。室溫遮光孵育15min后加入溶血劑搖勻，避光放置10min，再加入磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌，以1 500 r/min的速度離心5min，棄去上清，即可上機檢測。

1.3.3流式細胞儀分析采用美國BD公司FACSCALIBUR型流式細胞儀采集數據，激光波長為488、633 nm，采用EXP3.2V1.2B軟件進行多重設門顏色示蹤法對獲取的數據進行分析。如果在篩選時白血病細胞出現的區域內有細胞呈現，那么以這些殘存的白血病細胞所占骨髓或外周血單個核細胞總數的比例作為MRD值；多個抗體組合時以數值最大者作為MRD值。

1.4統計學處理應用SPSS 16.0統計軟件進行數據分析，分類變量采用χ2檢驗或Fisher確切概率法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結　果

2.136例AL患者首次誘導化療后MRD水平及各組間復發率比較跟蹤36例患者進行動態MRD檢測1～3年，首次誘導MRD＞1×10-2組22例，18例在3～9個月內復發；MRD為1×10-4～1×10-2組6例，3例在8～12個月內復發；MRD＜1×10-4組8例，1例在14個月時復發。MRD＞1×10-2組復發率明顯高于MRD＜1×10-4組，差異有統計學意義（P=0.003），而MRD＜1×10-4組復發率較MRD為1×10-4～1×10-2組低，但差異無統計學意義（P= 0.059）。見表1。

表1　36例AL患者首次化療后MRD水平及各組間復發率比較［n（%）］

2.2形態學完全緩解時MRD的提前判斷準確性對本次研究的36例患者進行動態檢測發現，形態學呈現完全緩解狀態時，MRD＜1×10-4組預后良好（復發率僅為12.5%），MRD＞1×10-2組預后差（復發率高達81.8%），提示有高風險復發可能性，對于MRD為1×10-4～1×10-2組（復發率為50.0%），提示有復發傾向，建議每月檢測。

2.330例AL患者化療后外周血與骨髓MRD水平30例患者中，外周血MRD＞1×10-214例，MRD為1×10-4～1×10-27例，MRD＜1×10-49例；而骨髓檢測情況略有不同：骨髓MRD＞1×10-28例，MRD為1×10-4～1×10-210例，MRD＜1×10-412例。

3　討　論

目前，AL的緩解率、長期生存率雖明顯提高，但仍有較多的患者發展為復發/難治性白血病，其治療難度和風險大幅提高。因此，減少AL緩解后再復發，早期預測復發風險并采取相應的干預措施顯得尤為重要。近年來，許多報道顯示，MRD水平與AL預后相關，可提示早期復發［4］。而MRD的監測可從細胞遺傳學、分子遺傳學及免疫學水平進行。由于細胞遺傳學及免疫學檢測的陽性率較低，且白血病的發病本質應追溯至分子水平，因此分子水平的監測更精確［5］。但FQ-PCR成本高，主要是對已知基因突變的監測，而FCM相對FQ-PCR成本低，操作方便，且在臨床上應用廣泛，因此本研究主要采用FCM進行MRD檢測。

AL與MRD關系的研究首先由德國研究組進行，其研究表明，在成人急性淋巴細胞白血病患者治療的第1年內9個時間點MRD與預后的關系中，多個時間點MRD對疾病復發具有預測價值；之后的多項研究表明，誘導治療后MRD＞10-3是一個強烈的獨立預后因素，均提示疾病復發［6-7］。本研究通過動態監測發現，首次完全緩解后MRD＜10-4是預后良好的指標，但當MRD水平持續大于10-2時復發風險明顯增高，復發前MRD水平均大于10-2，MRD復發早于形態學復發。因此，不妨把MRD作為監測白血病復發的獨立指標。另外有研究顯示，誘導及鞏固治療后MRD水平與AL患者的臨床預后有關，而且二者比較，鞏固治療后MRD水平對其有著更大的影響［8］。大量研究證實，AL患者MRD水平是獨立的預后指標，MRD＜10-4是當前國際上公認的預后好的標志［9-10］。

San Miguel等［11］的研究發現，誘導治療后MRD高于5×10-3的患者復發率明顯增高，而強化治療后MRD＞2×10-3也可以作為閾值區分低危組及預后不良組。而Buccisano等［12］研究結果顯示，鞏固化療后MRD監測更加有意義，用FCM測得MRD高于3.5×10-4的患者復發率明顯升高。MRD監測對AML的療效和預后判斷有著非常重要的意義［13］。

隨著血液學的發展，目前國際上推薦對白血病的治療宜遵循個體化治療原則，故根據MRD水平等進行危險分層，然后制訂治療方案，使有高度復發傾向的患者在治療初期得到更及時、有效的治療，可有效減少疾病復發，提高治愈率，而對于低風險組（MRD＜10-4），給予強度低的治療以提高其生存質量。因此，MRD水平測定對AL有多重臨床意義：（1）判斷預后及復發；（2）危險度分層評估；（3）指導個體化治療；（4）移植前后風險評估。

AML患者MRD監測手段多樣，包括染色體核型、熒光原位雜交、FQ-PCR等技術，其中FCM應用范圍最廣，準確性及敏感性均較高。但是關于MRD的監測還有一些不一致的觀點，如檢測技術和抗體選擇等，不同實驗室采用方法及抗體選擇不一。而在臨床上，AL本身具有高度異質性，FCM如何更好地做到個體化，今后還需做進一步的探討，對于MRD的認識仍需進一步加深，現有研究使用外周血檢測MRD能否替代骨髓檢查有待進一步證實［14］。

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［2］張志向，柴憶歡，何海龍，等.急性淋巴細胞白血病患兒骨髓微小殘留病檢測的臨床意義［J］.實用兒科臨床雜志，2010，25（15）：1133-1135.

［3］Mrózek K，MarcucciG，Paschka P，etal.Clinical relevance ofmutations and gene-expression changes in adult acutemyeloid leukemia with normalcytogenetics：are we ready for a prognostically prioritized molecular classification［J］.Blood，2007，109（2）：431-448.

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［11］San Miguel JF，VidrialesMB，López-BergesC，etal.Early immunophenotypical evaluation ofminimal residual disease in acutemyeloid leukemia identifiesdifferentpatient risk groupsandmay contribute to postinduction treatmentstratification［J］.Blood，2001，98（6）：1746-1751.

［12］Buccisano F，Maurillo L，Gattei V，etal.The kinetics of reduction ofminimal residual disease impacts on duration of response and survival of patientswith acutemyeloid leukemia［J］.Leukemia，2006，20（10）：1783-1789.

［13］Venditti A，Buccisano F，Del Poeta G，et al.Level ofminimal residual disease after consolidation therapy predicts outcome in acute myeloid leukemia［J］.Blood，2000，96（12）：3948-3952.

［14］鐘旭姝，蘭菲，崔旭，等.初發急性髓系白血病誘導化療后外周血MRD早期檢測與臨床療效的關系［J］.中國實驗血液學雜志，2013，21（1）：57-61.

讀者·作者·編者

關于論文“討論”的基本要求

現就有關論文中討論的基本要求介紹如下：（1）討論應圍繞論文的主題及中心內容，闡明本論文研究的原理和概念；（2）分析結果中各種數據或現象的理論根據；（3）對結果的理論或實踐意義進行科學評價，但應與主題和結果緊密聯系；（4）客觀、恰當地評價研究成果的應用價值，指出結果的可能誤差；（5）指出存在的問題，提出新的研究方向或展望，給讀者以啟迪；（6）用語應精煉，避免對前文內容、方法與結果的過多重復；（7）應重點突出，主次分明。

本刊編輯部

Clinical significance of dynam ically monitoring m inimal residual disease in prognosis of acute leukem ia

Wu Yuling，Wang Fukang，Wang Qiong，Wang Yong，Yu Chao，Xu Youshan，Wang Liding，Wu Jin′an，Zhang Saiwu△（Departmentof Hematology，Huangshan Municipal People′sHospital，Anhui245000，China）

ObjectiveTo investigate the clinical significance of dynamicallymonitoring theminimal residual disease （MRD）in predicting the recurrence and guiding the clinical therapy ofacute leukemia（AL）.Methods36 casesof initial AL in the hematology departmentofour hospital from January 2011 to December 2013 were selected and their bonemarrow and periph eralblood specimenswere collected fordetectingMRD by using the4-colormultiparameter flow cytometry（FCM）.The2-3 groups of4-colorantibodies combination were selected with CD45/SSC asgating，theMRD detection was performed once per1-3months after the end of the first induction chemotherapy，moreover the correlation between the change ofMRD levelwith AL recurrence was dynamicallymonitored.ResultsThe caseswere divided into 3 groups according to theMRD level after the end of the first induction therapy：MRD＞1×10-2group（22 cases），MRD 1×10-4-1×10-2（6 cases）and MRD＜1×10-4（8 cases）.The recurrence rate in the MRD＞1×10-2group was 81.8%（18/22），which was significantly higher than 12.5%（1/8）in the MRD＜1×10-4group，the differencewas statistically significant（P=0.003），which in theMRD 1×10-4-1×10-2group was50.00%（3/6），showing no statistical difference compared with the MRD＜1×10-4group（P=0.059）.The prognosis in MRD＜1×10-4was better.Among other 30 cases of AL for detecting peripheral blood and bonemorrow MRD，14 cases had peripheral blood MRD＞1×10-2，7 cases had peripheral blood MRD1×10-4-1×10-2，9 caseshad MRD＜1×10-4，8 caseshad bonemorrow MRD＞1×10-2，10 caseshad bonemorrow MRD 1× 10-4-1×10-2and 12 cases had bonemorrow MRD＜1×10-4.ConclusionThe MRD positive in AL patientsappears early than the morphology recurrence，therefore，dynamicallymonitoring MRD has an importance significance to predict the AL recurrence and guide the individualized therapy.

Neoplasm，residual；Leukemia；Acute disease；Prognosis；Flow cytometry

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.02.009

A

1009-5519（2016）02-0185-03

吳玉玲（1981-），主治醫師，主要從事血液病臨床診療工作。

，E-mail：530272323@qq.com。

2015-08-04）