酚酸類物質對人參種子的化感作用研究△

龍期良，李勇，高原，丁萬隆

(中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193)

酚酸類物質對人參種子的化感作用研究△

龍期良，李勇，高原，丁萬隆*

(中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京100193)

目的：研究7種常見酚酸類化感物質對人參種子萌發的影響。方法：采用浸種培養的方法，用含250、25、2.5、0.25mg·L-1酚酸類物質的水溶液在培養皿中培養人參種子，7d后測量人參種子胚根和胚軸長度，研究酚酸類化合物對人參種子萌發的自毒效應；另外，借助體視顯微鏡觀察酚酸脅迫對萌芽人參種子胚根形態的影響。結果：酚酸類物質對人參種子胚根和胚軸的化感作用強度與化合物種類及酚酸濃度密切相關。低濃度酚酸類物質對人參種子的胚根和胚軸的生長起促進作用，高濃度酚酸類物質對人參種子的胚根和胚軸的生長起抑制作用。此外研究還發現，酚酸類物質對人參根尖的形態和根毛的生長也有不同程度影響。結論：酚酸類物質對人參正常生長及人參根尖顯微形態結構均具有化感作用。

酚酸；人參；種子；自毒作用

人參PanaxginsengC.A.Meyer為五加科人參屬植物，為我國特有的名貴中藥材。人參忌地性極強，栽過一茬后的土壤幾十年內無法重復栽參。人參的連作障礙已成為人參產業可持續發展的主要制約因素之一。已有研究表明，導致人參連作障礙的原因除了土壤理化性質劣變，病原微生物累積外，自毒作用也是導致人參連作障礙出現的一個主要因素[1]。酚酸類物質是植物生命活動中產生的一類次生代謝產物。近年來，酚酸類物質作為一類主要的植物化感物質受到廣泛關注[2]。在人參連作障礙研究過程中，雷鋒杰等[3]研究證實人參根際分泌物中含有對人參具有自毒作用的化感物質。吳立潔等[4]從三七根際土壤中檢測到了苯甲酸等6種酚酸類物質。高微微等[5]從西洋參根際土壤中檢測到了香草酸等酚酸類化感自毒物質。李勇等[6]從人參根際土壤中分離并鑒定了苯甲酸等化感物質。越來越多證據表明，化感自毒效應與自毒物質種類及濃度呈現明顯相關性，不同種類化感物質對人參的自毒作用強度存在明顯差異[7-9]。本實驗選取了從老參地分離并鑒定的7種酚酸類化感物質[5-6]，研究了其對人參種子生長及人參根尖顯微形態結構的影響，從而為闡明酚酸類化感物質在人參連作障礙中的自毒作用機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料

經過后熟的人參種子于2015年4月采自吉林省撫松縣人參種植基地。人參種子先用自來水沖洗干凈，再用1000倍的50%多菌靈可濕性粉劑處理15min，自來水反復沖洗多次，在25℃恒溫保濕培養2d，從中選擇發芽整齊、顆粒飽滿的種子開展自毒效應研究。

供試藥劑：(A)苯甲酸；(B)肉桂酸；(C)阿魏酸；(D)水楊酸；(E)香草酸；(F)對羥基苯甲酸；(G)香蘭素均為分析純，購于北京化學試劑有限公司。

1.2方法

分別稱取1g(A)苯甲酸、(B)肉桂酸、(C)阿魏酸、(D)水楊酸、(E)香草酸、(F)對羥基苯甲酸、(G)香蘭素，溶于4mL無水乙醇中，配制成250mg·mL-1母液，根據本課題組測定的人參根際土壤中酚酸類物質的含量[6]以及高微微等[5]測定的老參地中酚酸類物質的含量，用蒸餾水將母液稀釋成250、25、2.5、0.25mg·L-1工作液備用。

采用玻璃培養皿法，在Φ9cm的玻璃培養皿底部鋪兩層滅菌濾紙，分別加入5mL上述工作液，均勻擺放10粒滅菌處理的人參種子，以加蒸餾水為對照，每個處理3次重復。種子在培養箱中避光保濕培養，7d后，參考黃小芳等[7]人參化感自毒作用的研究方法，用直尺測量人參種子胚根長和胚軸長。在LeicaS8APO型體視顯微鏡下，AnymicroDSSYT-7M型顯微數碼攝影儀系統10倍放大視野下觀察人參幼根根尖形態。

1.3數據分析

參照Williamson等[10]的方法采用化感效應指數(RI)表示化感自毒作用強弱，其中RI=(T1-T0/T0)(T1為實驗組測量值，T0為對照組測量值)。當RI>0為促進效應，RI<0為抑制效應。利用化感綜合效應指數(SE)表示化感自毒作用的綜合效應，SE為同種處理下人參種子胚根和胚軸長的化感效應指數RI的平均值[11]。試驗數據采用SPSS13.0和One-way ANOVA單因子方差分析，結合LSD-Test法對統計結果在0.05水平下進行差異顯著性分析，確定處理組和對照組之間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1酚酸類物質對人參種子胚根生長的影響

如表1所示，低濃度酚酸類物質對人參種子胚根的生長主要起促進作用，高濃度則起抑制作用。在0.25mg·L-1濃度下，B、D和E組人參種子胚根的生長與對照組相比具有顯著差異(P<0.05)，而A、C、F和G組人參種子胚根的生長與對照組相比無顯著差異。在2.5mg·L-1濃度下，A、D、E、F和G組人參種子胚根的生長與對照組相比具有顯著差異(P<0.05)，而B和C組人參種子胚根的生長與對照組相比無顯著差異。當濃度超過25mg·L-1時，7種酚酸類物質處理下的人參種子胚根的生長與對照組相比均具有顯著差異(P<0.05)。

表1 酚酸類物質對人參種子胚根生長的影響

注：同列中不同字母表示處理間在P<0.05水平存在差異顯著，下同。

如圖1所示，不同酚酸類物質對人參種子胚根生長的自毒效應不同，同種酚酸對人參種子胚根生長的自毒作用強度與濃度有密切的關系。當濃度為0.25 mg·L-1時，B、C、D、E、F、G的RI>0，表明這些物質在0.25 mg·L-1濃度下對人參種子胚根的生長起促進作用，其中B、D、F的化感效應指數與對照組相比具有顯著差異(P<0.05)。而A的RI<0，表明A在0.25 mg·L-1濃度下，對人參種子胚根的生長起抑制作用，但其化感效應指數與對照相比無顯著差異。當濃度為2.5mg·L-1時，A、B、C、D、E、F、G的RI<0，表明這些物質在2.5 mg·L-1時，對人參種子胚根的生長均起抑制作用，其中A、D、E、F、G的化感效應指數與對照相比具有顯著差異RI<0。當濃度≥25 mg·L-1時，7種物質的化感效應指數與對照相比均具有顯著差異(P<0.05)。

*表示處理組與對照組的自毒效應指數差異顯著(P<0.05)，下同。圖1 酚酸類物質對人參種子胚根的自毒效應

如圖2所示，酚酸類物質對人參種子胚根生長的影響還表現在根尖形態上。當濃度為25 mg·L-1時，根尖頂端部分開始出現彎曲或變小。當濃度為250 mg·L-1時，根尖部分的根毛減少，根尖出現損傷或腐爛。

圖2 酚酸類物質對人參種子根尖形態的影響(根尖長約5 mm)

2.2酚酸類物質對人參種子胚軸生長的影響

如表2所示，酚酸類物質對人參種子胚軸生長的影響也主要表現為，低濃度起促進作用，高濃度則起抑制作用。在0.25mg·L-1濃度處理下，B、C、D、E、F組人參種子胚軸的生長與對照組相比具有顯著差異(p<0.05)，而A和G組人參種子胚軸的生長與對照組相比無顯著差異。在2.5mg·L-1濃度處理下，B、C、D和G組人參種子胚軸的生長與對照相比具有顯著差異(P<0.05)，而A、E、F組人參種子胚軸的生長與對照組無顯著差異。當濃度≥25mg·L-1時，7種酚酸類物質處理下的人參種子胚軸的生長與對照組相比均具有顯著差異。

表2 酚酸類物質對人參種子胚軸生長的影響

如圖3所示，B、C和F組在濃度≤2.5 mg·L-1時，其RI>0，表明B、C和F在濃度低于2.5 mg·L-1時，對人參種子胚軸的生長起促進作用，其中B和C組的化感效應指數與對照相比差異顯著(P<0.05)，而F組只在濃度低于0.25 mg·L-1時，其化感效應指數與對照相比差異顯著(P<0.05)。A、D、E和G組在濃度為0.25 mg·L-1時，其RI>0，表明A、D、E和G在濃度為0.25 mg·L-1時，對人參種子胚軸的生長起促進作用，其中E組的化感效應指數與對照相比差異顯著(P<0.05)。A、D、E和G組在濃度為2.5 mg·L-1時，其RI<0，表明A、D、E和G在濃度為2.5 mg·L-1時，對人參種子胚軸的生長起抑制作用，其中G組的化感效應指數與對照相比差異顯著(P<0.05)。當濃度≥25 mg·L-1時，7種酚酸類物質的RI<0，表明這7種物質在濃度大于25 mg·L-1時，對人參種子胚軸的生長起抑制作用，而且其化感效應指數與對照相比均具有顯著差異(P<0.05)。

圖3 酚酸類物質對人參種子胚軸的化感自毒效應

2.3酚酸類物質對人參種子生長的化感綜合效應

如表3所示，7種酚酸類物質對人參種子的化感綜合效應總體表現為低促高抑。在0.25mg·L-1濃度處理下，7種酚酸類物質對人參種子的生長起促進作用，隨濃度增加，促進作用逐漸降低或轉為抑制作用。當濃度≥25mg·L-1時，7種酚酸類物質對人參種子的生長均表現為抑制作用，而各酚酸類物質的化感綜合效應的強弱順序隨著濃度的變化而變化。當濃度為25mg·L-1時，各酚酸類物質的化感綜合效應指數大小順序為：D>B>E>C>A>F>G，而當濃度為250mg·L-1時，各酚酸類物質的化感綜合效應指數大小順序為：E>F>D>G>C>B>A。

表3 酚酸類物質對人參種子生長的化感綜合效應指數

3 討論

連作條件下，藥用植物隨栽培年限增加，根系分泌的自毒物質逐漸積累，當濃度足夠高時，就會影響植株正常生長產生不利影響，進而引發連作障礙[12]。連作障礙長期困擾人參種植產業的健康發展，該問題的產生是人參-土壤-微生物等因素綜合作用的結果[1]。化感自毒作用是導致人參連作障礙的主要原因之一，根際分泌物中的酚酸類化合物在植物自毒作用和連作障礙中具有重要的作用[13-14]。李勇等[6]從人參的根際土壤中分離并鑒定了苯甲酸等酚酸類物質。張愛華等[15]從人參的根際分泌物中鑒定出了酚酸類化合物。本實驗選取了包括苯甲酸在內的7種常見酚酸類化合物，證實了這些酚酸類化合物對人參種子的生長均具有化感自毒作用，其化感作用規律總體表現為低濃度促進人參種子的生長，高濃度抑制人參種子的生長。并且，在此基礎上明確了人參對酚酸類物質化感作用的耐受閾值濃度在2.5×10-4-2.5×10-3g·L-1之間。高微微等[5]研究證實西洋參對酚酸類物質化感作用的耐受閾值在9×10-4-1.1×10-3g·L-1之間，與本研究結果基本一致。這表明，人參和西洋參對酚酸類物質化感自毒作用的敏感性上具有一致性。楊家學等[16]研究證實小麥、玉米、水稻等農作物對酚酸類物質的耐受閾值在5×10-3-2.5×10-2g·L-1之間。這表明農作物對酚酸類物質的耐受閾值高于人參和西洋參，這為參糧輪作的實施提供了直接的理論依據。

研究還發現，不同酚酸類物質對人參胚根和胚軸的生長存在差異，而且不同濃度下各酚酸類物質的化感綜合效應指數的強度順序也存在差異，筆者推測這可能是不同酚酸類物質在人參細胞中的作用機理存在差異或是人參對不同酚酸類物質的敏感程度不同。不同酚酸類物質的作用潛力及其化感自毒作用機理還有待今后深入研究，以便為人參連作障礙的消除提供新思路。

植物的形態結構與周圍的環境總是相適應的，逆境環境影響植物生長，并可引起植物形態結構的相應變化[17]。植物形態和生長方面對環境脅迫的反應都比較直觀，了解植物受環境脅迫后形態結構的變化規律，可為植物的受損機理以及抗逆研究提供直觀的證據[18]，許世泉等研究了人參根際土壤提取物對人參根尖組織結構的影響，證實了人參化感物質能破壞人參根尖的組織結構，從而抑制人參的正常生長。這與本文的研究結果一致，此外，本研究還發現酚酸會影響人參根毛的正常生長。根毛是植物根部表皮細胞上的一些頂端封閉的管狀突起，是植物根系功能區段生理活性界面的重要組成部分[19]。這表明影響根毛的生長可能是酚酸類物質對人參化感作用的主要作用方式之一，但其作用機理還有待研究。

[1] 簡在友，王文全，孟麗，等.人參屬藥用植物連作障礙研究進展[J].中國現代中藥，2008，10(6)：3-5.

[2] 謝星光，陳晏，卜元卿，等.酚酸類物質的化感作用研究進展[J].生態學報，2014，34(22)：6417-6428.

[3] 雷鋒杰，張愛華，方斯文，等.人參根系分泌物對4種藥用植物的化感作用研究[J].中國農學通報，2010，26(19)：140-144.

[4] 吳立潔，劉杰，王文祎，等.三七根際土壤中酚酸類物質的鑒定及含量測定[J].世界科學技術——中醫藥現代化，2014，16(4)：825-829.

[5]HeCN，GaoWW，YangJX，etal.IdentificationofautotoxiccompoundsfromfibrousrootsofPanaxquinquefoliumL.[J].PlantandSoil，2009，318(1)：63-72.

[6]LiY，HuangXF,DingWL.AutotoxicityofPanaxginsengrhizosphereandnon-rhizospheresoilextractsonearlyseedlingsgrowthandidentificationofchemicals[J].AllelopathyJournal，2011，28(2)：145-154.

[7] 黃小芳，李勇，易茜茜，等.五種化感物質對人參根系酶活性的影響[J].中草藥，2010，41(1)：117-121.

[8] 黃小芳，李勇，丁萬隆.人參根系分泌物對種子萌發的自毒效應[J].種子，2009，28(10)：4-7.

[9] 黃小芳，李勇，劉時輪，等.五種化感物質對人參幼根皂苷含量的影響[J].世界科學技術——中醫藥現代化，2009，11(1)：70，71-74.

[10]WilliamsonGB，RichardsonD.Bioassaysforallelopathy：Measuringtreatmentresponseswithindependentcontrols[J].JournalofChemicalEcology，1988，14(1)：1573-1561.

[11] 李發林，黃炎和，張漢榮，等.幾種水土保持型牧草葉浸提液化感作用效應[J].中國農學通報，2010，26(18)：401-405.

[12] 張重義，林文雄.藥用植物的化感自毒作用與連作障礙[J].中國生態農業學報，2009，17(1)：189-196.

[13] 吳連舉，趙亞會，關一鳴，等.人參連作障礙原因及其防治途徑研究進展[J].特產研究，2008，(2)：68-72.

[14] 吳鳳芝，趙鳳艷.根系分泌物與連作障礙[J].東北農業大學學報，2003，34(1)：114-118.

[15] 張愛華，彭洪利，雷鋒杰，等.人參根系分泌物的提取及鑒定[J].西北農林科技大學學報(自然科學版)，2014，42(7)：191-196.

[16] 楊家學.西洋參酚酸類化合物的化感作用及影響因子研究[D].北京：中國協和醫科大學，2009.

[17] 楊春雪，卓麗環，柳參奎.植物顯微及超微結構變化與其抗逆性關系的研究進展[J].分子植物育種，2008，6(2)：341-346.

[18] 史湘華，姜國斌，殷鳴放，等.植物體內滲透調節物質及組織結構與耐鹽性的關系[J].內蒙古林業調查設計，2007，30(1)：54-57.

[19] 張德健，夏仁學，曹秀，等.生長調節劑和基質對枳根毛發育的影響[J].應用生態學報，2011，22(6)：1437-1442.

AllelopathyofPhenolicCompoundsonPanaxginsengSeeds

LONGQiliang，LIYong，GAOYuan，DINGWanlong*

Objective：To research the allelopathic effects of seven phenolic compounds onPanaxginsengseeds.Methods：TheP.ginsengseeds were cultivated on petri dish with0.25，2.5，25，250mg·L-1phenolic solution，the lengths of radicle and plumule of ginseng seeds were examined seven days later.Furthermore，the effects of phenolic on morphology of radicle of ginseng seeds were observed by stereomicroscope.Results：The allelopathic potential of phenolic on radicle and plumule of ginseng seeds were closely related to the species and concentrations of phenolic compounds.The growth of radicle and plumule of ginseng seeds were promoted at low concentrations of phenolic，but it was inhibited at high concentrations of phenolic.Moreover，this study found that the phenolic could influence the morphology of radicle and the growth of root hair.Conclusion：Phenolic compounds had allelopathy on the growth ofP.gisengand micromorphology of radicle.

Phenolic；PanaxGinseng；Seed；Autotoxicity

(InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China)

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.1.012

2015-12-12)

國家自然科學基金項目(81072992；81373911)；中藥材種子種苗和種植(養殖)標準平臺(2012ZX09304006)

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丁萬隆，研究員，研究方向：藥用植物栽培及病害防治；E-Mail：wlding@implad.ac.cn