人參多糖檢測方法及提取工藝優選

肖志偉，樂智勇，朱國雪，梁生旺*

(1.廣東藥學院 國家中醫藥管理局中藥數字化質量評價技術重點研究室，廣東 廣州 510006；2.康美(北京)藥物研究院有限公司，北京 102629；3、廣東藥學院，廣東 廣州 510006)

人參多糖檢測方法及提取工藝優選

肖志偉1，樂智勇2，朱國雪3，梁生旺1*

(1.廣東藥學院 國家中醫藥管理局中藥數字化質量評價技術重點研究室，廣東 廣州510006；2.康美(北京)藥物研究院有限公司，北京102629；3、廣東藥學院，廣東 廣州510006)

目的：優選人參多糖檢測方法和最佳提取工藝。方法：對比幾種檢測人參多糖方法的結果，優選人參多糖檢測方法；采用正交試驗法，以多糖提取率為考察指標，以加水量、提取時間、提取次數為考察因素，優選人參多糖提取工藝。結果：人參最佳檢測方法為苯酚-硫酸法；最佳提取工藝為加水量12倍，每次提取1h，提取3次。結論：苯酚-硫酸法檢測人參多糖含量準確性高，方法穩定可行；優選工藝操作簡單，提取率高，穩定可行。

多糖檢測；人參多糖；水提工藝；正交試驗

人參為五加科植物人參PanaxginsengC.A.Mey.的干燥根。具有大補元氣、復脈固脫、補脾益肺、生津、安神之功能[1]。人參主要化學成分為多種人參皂苷、糖類、揮發油、氨基酸、有機酸及酯、維生素以及多種微量元素等[2]。現代藥理研究表明，人參皂苷具有增強免疫力[3]、抗腫瘤、抗衰老、抗病毒、保護心肌細胞[4]等作用；人參多糖在機體免疫調節[5]、降血糖[6]、抗氧化[7]、抗輻射[8]等方面亦具有顯著的藥理作用。由于人參多糖的活性、相對分子量、溶解度和結構的不同，不同的處理方法對其含量檢測的影響比較大。近年人參提取多為單一類成分的提取，利用率偏低。因此，本文對人參多糖檢測方法和人參醇提后的藥渣水提的提取工藝進行研究，為提高人參多糖檢測準確性和人參的利用率提供參考。

1 儀器與材料

1.1儀器

UV-2401PC型紫外分光光度計(杭州庫侖科技有限公司)；AL204型電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；XW-80A型旋渦混合儀(上海五九自動化設備有限公司)；低速臺式離心機800B(上海安亭科學儀器廠)；DHG-9001-1s型電熱恒溫鼓風干燥箱(成都浩馳儀器有限公司)。

1.2材料

人參購自康美(毫州)世紀國藥中藥有限公司；亞甲藍(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20150317)；D-無水葡萄糖(中國食品藥品檢定研究院，批號：110833-201205，含量≥99.5%)；無水乙醇、濃硫酸、苯酚、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、蒽酮、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、亞鐵氰化鉀均為分析純；水為雙蒸水。

2 方法與結果

2.1人參藥材預處理

取人參藥材，加10倍量濃度為70%的乙醇水溶液，提取3次，每次提取3h，濾過，回收提取人參皂苷后的殘留物，烘干備用。

2.2葡萄糖對照品溶液的制備

準確稱取105℃干燥至恒重的D-無水葡萄糖0.5g，加水溶解，并定容至50mL，此溶液質量濃度為10mg·mL-1，用前稀釋100倍(質量濃度為0.1mg·mL-1)。

2.3供試品溶液的制備

稱取預處理過的人參藥材50g，加入15倍量的水，100℃水浴提取3次，每次3h[9]，濾過，合并濾液，濃縮，加無水乙醇調濃度至80%，4℃冷藏，靜置4h。離心，棄去上清液，沉淀烘干作粗多糖樣品備用。精密稱取粗多糖樣品50mg，用蒸餾水溶解，并定容于50mL容量瓶中，制成一定濃度的多糖儲備液，備用。精密量取多糖儲備液2mL于25mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋到刻度，備用。

2.4多糖檢測方法研究

2.4.1苯酚-硫酸法 精密量取供試品溶液2mL于25mL比色管中，加入5%苯酚溶液1.0mL，在旋渦混合器上混勻，小心加入濃硫酸10mL，在旋渦混合器上小心混勻，置沸水浴中2min，冷卻至室溫。以蒸餾水為空白參比，在200～800nm波長范圍進行掃描，確定最大吸收波長[10]。

準確吸取葡萄糖對照品溶液0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL，置于25mL比色管中，加水至2.0mL，按2.4.1方法測定吸光度值(A)。以葡萄糖質量為橫坐標，吸光度值(A)為縱坐標進行線性回歸。

2.4.2蒽酮-硫酸法 精密量取供試品溶液2mL于25mL比色管中，加入0.1%蒽酮-硫酸溶液6mL，在旋渦混合器上混勻，沸水浴加熱10min，取出，在流水中冷卻20min。以蒸餾水為空白參比，在400～900nm波長范圍進行掃描，確定最大吸收波長[10]。

準確吸取葡萄糖對照品溶液0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL置于25mL比色管中，加水至2.0mL，按2.4.2方法測定吸光度值(A)。以葡萄糖質量為橫坐標，吸光度值(A)為縱坐標進行線性回歸。

2.4.3堿性酒石酸銅滴定法 精密量取供試品溶液1.5mL于10mL離心管中，加入15mL濃鹽酸，沸水浴加熱2h，冷卻，用氫氧化鈉溶液調pH至6.8～7.2，移至200mL容量瓶中，加水定容，濾紙濾過，濾液作為待測液備用。

標定堿性酒石酸銅液：用定量移液管吸取堿性酒石酸銅液甲、乙各5mL于150mL錐形瓶中，加10mL蒸餾水及數粒玻璃珠。用滴定管加入9.0mL葡萄糖對照品溶液于錐形瓶中，并將錐形瓶放在電爐上于2min內加熱至沸騰，并保持微沸狀態。用葡萄糖對照品溶液滴定溶液至藍色剛褪去為終點，記錄消耗葡萄糖對照品溶液的體積。平行3次，取平均值[10]。

供試品溶液測定：按2.4.3方法，用供試品溶液滴定終點。平行3次，取平均值。

2.4.4多糖含量檢測結果 見表1。

表1 多糖含量檢測結果

2.4.5 檢測方法重復性研究 按上述方法測定供試品溶液多糖含量，分別重復測定6次。3種檢測方法RSD值見表2。

表2 檢測方法重復性

由以上的結果可知苯酚-硫酸法準確率高，穩定可行，因此以下研究選擇苯酚-硫酸法作為人參多糖的檢測方法。

2.5苯酚-硫酸法方法學研究

2.5.1人參多糖最大吸收波長的選擇 精密量取供試品溶液2mL于25mL比色管中，加入5%苯酚溶液1.0mL，在旋渦混合器上混勻，小心加入濃硫酸10mL，在旋渦混合器上混勻，置沸水浴中2min，冷卻至室溫。以蒸餾水為空白參比，在200～800nm波長范圍進行掃描，確定最大吸收波長為486nm。

2.5.2標準曲線的制備 準確吸取葡萄糖對照品溶液0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL(分別相當于葡萄糖0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg)置于25mL比色管中，加水至2.0mL，按2.4.1項下方法測定吸光度值(A)。以葡萄糖質量為橫坐標，吸光度值(A)為縱坐標進行線性回歸，得線性回歸方程Y=5.1159X+0.0068，r=0.9994。結果表明，葡萄糖進樣濃度在9.422～99.924μg·mL-1線性關系良好。

2.5.3精密度試驗 精密吸取葡萄糖對照品溶液0.80mL于具塞試管中，按苯酚-硫酸法測定A值，重復測定6次，結果A值的RSD為0.978%，表明該方法精密度良好。

2.5.4穩定性試驗 精密吸取供試品溶液1.0mL于具塞試管中，按苯酚-硫酸法測定A值，每隔10min測定一次，測定2h。然后每隔20min測定一次，測定2h。再每隔30min測定一次，測定2h。結果A值RSD為0.952%，表明供試品溶液在6h內穩定性良好。

2.5.5重復性試驗 取一批樣品，按2.3項下方法平行制備6份供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液1.0 mL于具塞試管中，按苯酚-硫酸法測定A值，結果A值的RSD為1.984%，表明該方法重復性良好。

2.5.6 加樣回收率試驗 精密量取0.5 mL葡萄糖對照品溶液，加入0.5 mL供試樣品溶液，平行6份，按苯酚-硫酸法測定A值，計算回收率。結果平均回收率為101.34%，RSD值為1.638%[11]。

3 正交試驗優化水提工藝

3.1試驗方案設計

以多糖提取率為考察指標，采用L9(34)正交試驗對加水量(A)、提取時間(B)、提取次數(C)3個因數進行考察。因素水平見表3。

表3 L9(34)因素水平表

3.2樣品溶液制備

取9份經過預處理的人參藥渣，每份50g，按正交設計方案提取，過濾，濾液濃縮，加無水乙醇調濃度至80%，4℃冷藏靜置4h，離心，棄去上清液，沉淀，用蒸餾水溶解，定容，備用。

3.3樣品溶液含量測定

吸取上述溶液稀釋至合適濃度，按苯酚-硫酸法測定A值，計算多糖提取率。正交試驗結果見表4，方差分析結果見表5。

表4 L9(34)正交試驗設計與結果

表5 方差分析表

注：F0.05(2，2)=19；F0.01(2，2)=99；P<0.05。

由表4可知各因素對多糖提取率的影響排序為C>A>B。由表5方差分析可知3個因素中提取次數(C)差異有統計學意義(P<0.05)，其余各因素差異無統計學意義(P>0.05)。結合實際情況確定最佳提取條件為A3B1C3，即12倍加水量，每次提取1 h，提取3次。

3.4最佳工藝驗證試驗

取3批平行樣品，按最佳工藝提取，測定多糖含量，計算提取率，結果見表6，表明該工藝穩定可行。

表6 最佳工藝驗證結果

4 討論

人參多糖的檢測方法很多，過去研究多為某單一方法的研究，并未對幾種檢測方法進行對比研究，對人參藥材醇提后水提的多糖是否適用也沒有研究。本試驗對苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、堿性酒石酸銅滴定法3種方法進行對比研究，優選出最佳的方法，并對選擇的方法進行方法學考察，確定其適用于醇提后人參藥渣水提的多糖檢測。

人參糖類物質成分復雜，有單糖、低聚糖和多糖，經乙醇沉淀純化的多糖是可溶于水、不溶于醇的極性大分子化合物。蒽酮-硫酸法準確率高，但對純化過程要求高，重復性較差；堿性酒石酸銅滴定法需要將大分子多糖酸解成單糖標定，對操作過程要求高，準確率與重復性都不足；苯酚-硫酸法操作簡單、準確率高、重復性良好，是檢測多糖優選的方法。

本試驗以經過70%乙醇水溶液提取3次，每次3h，然后烘干的人參為樣品，通過正交試驗考察，得到人參經過醇提后多糖水提的最佳工藝：加水量為12倍，每次提取時間為1h，提取3次。在最佳提取條件下，人參多糖的提取率約為8.35%，充分提取了人參藥材的多糖，提高了人參藥材的利用率。

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OptimizationofDetectionMethodandExtractionTechnologyofGinsengPolysaccharides

XIAOZhiwei1，LEZhiyong2，ZHUGuoxue3，LIANGShengwang1*

(1.GuangdongPharmaceuticalUniversity，KeyLaboratoryofDigitalQualityEvaluationTechniqueofTraditionalChineseMedicine(TCM)，StateAdministrationof(TCM)，Guangzhou510006，China；2.BeijingKangmeiPharmaceuticalResearchInstituteCo.Ltd，Beijing102629，China；3.GuangdongPharmaceuticalUniversity，Guangzhou510006，China)

Objective：To optimize the detection method and extraction technology of ginseng polysaccharides.Methods：The ginseng polysaccharide detection method was optimized by comparing the results of several detection methods.The extraction technology of polysaccharide fromPanaxginsengwas optimized by orthogonal test with amount of water，extraction time and extraction times as factors and with the content of polysaccharide as index.Results：The best detection method of ginseng polysaccharides was the method of phenol vitriol，the optimal condition of extraction technology was as following：12-folds water，extraction time of1.0h，extraction times of three times.Conclusion：The method of phenol vitriol is high accuracy and the extraction technology is simple，stable and practical with high extraction rate.

Polysaccharide detection；ginseng polysaccharide；water-extraction technology；orthogonal test

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.1.015

2015-10-20)

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梁生旺，教授，研究方向：中藥質量控制；Tel：(020)39352172，E-mail：swliang371@163.com