醫院感染腸桿菌屬中整合子的檢測及耐藥性分析

宗勁，吳淼星，胡慶豐

醫院感染腸桿菌屬中整合子的檢測及耐藥性分析

宗勁，吳淼星，胡慶豐

目的研究無菌部位標本分離的腸桿菌屬細菌中Ⅰ、Ⅱ類整合子及相關基因盒的分布，分析整合子與細菌耐藥性的關系。方法用多重聚合酶鏈反應（PCR）檢測第Ⅰ、Ⅱ類整合子，對整合酶基因可變區進行序列分析；用微量稀釋法檢測試驗菌株對17種抗生素的耐藥性。結果在103株試驗菌中有30株攜帶I類整合子，檢出率為29.1%，耐藥基因主要為aac（6'）-Ib-Cr、aadA2、aadA1；未檢測出Ⅱ類整合子。除阿莫西林/克拉維酸、頭孢唑啉、頭孢西丁，Ⅰ類整合子陽性組耐藥率均高于陰性組（均＜0.05）。結論整合子與腸桿菌屬耐藥性密切相關，在腸桿菌屬耐藥機制中起重要作用。

腸桿菌屬；整合子；基因盒

整合子在細菌基因組進化、傳播、介導細菌耐藥性方面起重要作用［1-2］，目前已經發現多種類型。腸桿菌屬細菌是臨床常見革蘭陰性桿菌，常引起呼吸道、尿路、傷口甚至全身感染。本研究腸桿菌屬細菌的Ⅰ、Ⅱ類整合子及可變區基因盒分布，并探討整合子與腸桿菌屬細菌耐藥性的關系。報道如下。

1　資料與方法

1.1菌株來源收集2011年10月至2013年12月浙江省人民醫院非重復分離住院患者無菌部位腸桿菌屬細菌103株，所有菌株經梅里埃公司 VITEK 2 compact全自動微生物分析鑒定系統進行鑒定和藥敏試驗；質控菌株為ATCC27853（銅 綠 假 單 胞 菌）、ATCC25922（大腸埃希菌），I、II類整合子陽性對照菌株由本實驗室保存。

1.2儀器與試劑試劑：Premix Taq DNA聚合酶、LA Taq DNA聚合酶、DNA標志物購自大連TaKaRa公司，細菌基因組DNA提取試劑盒購自上海生工生物公司。儀器：VITEK2 compact全自動微生物分析鑒定系統（法國生物梅里埃公司），S1OOOThermal Cycler擴增儀（美國BIO-RAD公司），電泳儀（美國BIO-RAD公司），凝膠成像分析系統（美國BIO-RAD公司）。

1.3菌株DNA的提取將103株試驗菌株和Ⅰ、Ⅱ類整合子陽性對照菌株分別劃線接種于血平板上，37℃培養過夜；分離培養得單個菌落。挑取單個菌落加入50 l無菌雙蒸水混勻，100℃沸水浴10 min，裂解細菌釋放DNA，12000r/min離心5 min取上清液作為擴增模板。

1.4菌株Ⅰ、Ⅱ類整合子篩查建20 lPCR反應體系：去離子水8.2 l、Premix TaqDNA聚合酶10 l、引物intiF和intiR 各0.4 l、模板1 l。擴增條件：94℃裂解5 min，隨后95℃解鏈60 s、55℃退火40s、72℃延伸40s（Ⅰ類整合子）/60s（Ⅱ類整合子），共進行35個循環，最后72℃延伸5 min。各取5 l上述擴增產物加到含溴化乙啶0.4 g/ml的1%瓊脂糖凝膠加樣孔中進電泳，于紫外線下觀察，與陽性對照在同一位置出現明顯條帶者判為陽性。

1.5Ⅰ類整合子可變區擴增及測序分析建40 l反應體系：緩沖液4 l、dNTP 3.8 l、引物各3CS和5CS各2 l、LaTaq DNA聚合酶0.2l、上述Ⅰ類整合子模板2 l、去離子水26 l。擴增條件：94℃裂解5 min，隨后95℃解鏈60 s、56℃退火40 s、72℃延伸5 min，共35個循環。各取5 l上述擴增產物加到含溴化乙啶0.4 g/ml的1%瓊脂糖凝膠加樣孔中進電泳，于紫外線下觀察。用引物5CS 和3CS進行測序分析（委托上海生物工程公司雙向測序），經序列比對以確定整合子可變區基因盒的種類。

1.6統計方法用SPSS17.0統計軟件進行處理，計數資料比較采用2檢驗。＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1Ⅰ、Ⅱ類整合子篩查結果103株腸桿菌屬細菌中Ⅰ類整子陽性有30株，陽性率為29.1%，未篩查到Ⅱ類整合子陽性菌株。部分菌株Ⅰ類整子電泳見封四彩圖1。

2.2Ⅰ類整合子可變區擴增及測序結果30株Ⅰ類整合子陽性菌株中20株擴增出可變區。檢出800bp（2株），1 300 bp（16株），3 000 bp（1株），4 000 bp（1株）4種不同片段PCR產物。其中16株攜帶基因盒序列aac（6'）-Ib-Cr，7株同時攜帶aadA2；2株攜帶aadA1；1株為3kb、1株為4 kb測序結果比對不明確，有待進一步研究。Ⅰ類整合子部分菌株可變區電泳見封四彩圖2。

2.3耐藥率分析Ⅰ類整合子陽性菌株耐藥率均高于Ⅰ類整合子陰性菌株（均＜0.05），除阿莫西林/克拉維酸、頭孢唑啉、頭孢西丁。見表1。

表1　整合子陽性菌株與陰性菌株耐藥情況比較　　株（%）

3　討論

整合子是根據整合酶一級結構不同進行分類；第Ⅰ類整合子在臨床相關菌株中分布最廣，其主要由5CS、3CS及兩者間的可變區3個部分組成。其中5CS是整合子的基本結構，包括可變區啟動子（Pant）、整合酶基因intI1及重組位點attI［3］。可變區在細菌耐藥中發揮重要作用，因常帶有不同數量及種類的基因盒。本研究檢出耐藥基因 aac（6'）-Ib-cr、aadA1、aadA2。喹諾酮類修飾酶基因aac （6'）-Ib-cr是由氨基糖苷類乙酰轉移酶基因aac（6'）-Ib的兩處堿基突變的結果，從而賦予了作用于氨基糖苷類和喹諾酮類兩類抗菌藥物的特性［4］。Aac（6'）-Ib-cr基因多位于整合子或可移動的遺傳元件上，也可與其他耐藥基因共存于同一質粒，從而導致細菌多重耐藥［5］。aadA2編碼氨基糖苷-3″-腺苷酰基轉移酶，賦予細菌對鏈霉素和壯觀霉素耐藥，是第1類整合子中最常見的基因之一［6］；aadA1是編碼對鏈霉素、氟哌酸和甲氧芐啶耐藥最常見基因［7］。

本研究中腸桿菌屬Ⅰ類整合子檢出率為29.1%，低于近年報道的大腸埃希菌53.89%［8］和肺炎克雷伯菌41.70%［9］的檢出率；這與大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌更高的抗生素選擇性壓力有關。本研究顯示，除阿莫西林/克拉維酸、頭孢唑啉、頭孢西丁，Ⅰ類整合子陽性組耐藥率均高于陰性組（均＜0.05）。其中兩組細菌對氨基糖苷類、喹諾酮類的耐藥率差異，與試驗結果中Ⅰ類整合子所攜帶的基因盒相符合。本研究中對所有試驗菌株進行 -內酰胺酶類耐藥基因篩查發現：Ⅰ類整合子陽性組同時SHV基因陽性有13株，這與三代頭孢、碳青霉烯類、哌拉西林/他唑巴坦、氨曲南的耐藥率明顯高于陰性組相符合。這可能因為整合子在這些耐藥基因轉移過程中起到了作用，但 -內酰胺酶類耐藥基因并不常存在基因盒中。整合子是細菌適應外界環境進化的結果，抗菌藥物廣泛、大量應用是細菌整合子進化和捕獲更多耐藥基因的重要原因；因此合理使用抗生素，降低抗生素所造成的選擇性壓力，從而減少耐藥菌株的產生與播散。

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10.3969/j.issn.1671-0800.2016.04.067

R446.12

A

1671-0800（2016）04-0540-03

2015-11-10

（本文編輯：孫海兒）

321017浙江省金華，金華市中醫醫院（宗勁、吳淼星）；浙江省人民醫院（胡慶豐）

宗勁，Email：345437383@qq.com