全反式維甲酸聯合順鉑在誘導人頭頸癌TCA8113細胞凋亡中的作用

孫　強，邱　峰,趙軍方，方　政，李新明，孫明磊

(1.鄭州大學第一附屬醫院口腔頜面外科，河南 鄭州 450052；2.河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室，河南 鄭州 450052)

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全反式維甲酸聯合順鉑在誘導人頭頸癌TCA8113細胞凋亡中的作用

孫強1,2，邱峰1,趙軍方1，方政1，李新明1，孫明磊1

(1.鄭州大學第一附屬醫院口腔頜面外科，河南 鄭州 450052；2.河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室，河南 鄭州 450052)

目的研究全反式維甲酸(ATRA)與順鉑對人頭頸癌TCA8113細胞凋亡的影響。方法ATRA和順鉑單獨及聯合作用于TCA8113細胞，采用MTT法檢測細胞生長，并觀察細胞形態變化；使用流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡；通過western blot實驗檢測caspase-3表達情況。結果ATRA作用于TCA8113細胞后，細胞生長明顯受到抑制，細胞形態發生改變，細胞凋亡比例明顯增加，caspase-3蛋白表達下調，ATRA與順鉑聯合作用于腫瘤細胞后，其抑癌作用加強。結論ATRA聯合順鉑對人頭頸癌TCA8113細胞具有協同抑癌作用。

TCA8113細胞；全反式維甲酸；順鉑；細胞凋亡

[Abstract]ObjectiveTo observe the effect of all-trans retinoic acid (ATRA) and cisplatin on the proliferation of human head and neck cancer TCA8113 cells.MethodsTCA8113 cells were treated with ATRA and (or) cisplatin respectively.Cell proliferation was detected by the method of MTT.Cell cycle was detected by flow cytometry.ResultsThe growth of the cells treated with ATRA was inhibited obviously and the morphology of the cells were changed.The apoptosis rate of TCA8113 cells was increased gradually and the effect was enhanced when combined ATRA with cisplatin.ConclusionATRA could inhibit the proliferation of human head and neck cancer TCA8113 cells and the inhibitory effect was synergistic when ATRA combined with cisplatin.

[Key words]TCA8113 cells; all-trans retinoic acid; cisplatin; cell apoptosis

頭頸部中最常見的惡性腫瘤病理類型為鱗癌，約占成人病例數的90%[1]。頭頸部惡性腫瘤的發生率較高，位居全身惡性腫瘤的第6位，化療目前仍是提高惡性腫瘤生存率和生活質量最有效的方法，因此尋找針對惡性腫瘤特異性的低毒、高效藥物是重要的研究方向。全反式維甲酸全反式維甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)最初用于急性早幼粒細胞白血病的治療，近年來已有報道其在實體瘤治療方面作用明顯。順鉑是鉑類抗腫瘤化合物，是臨床常用化療藥物。根據2種藥物的不同作用機制，其聯合用藥于頭頸鱗癌是否能夠起到協同抑癌作用，目前尚未見明確報道。本研究旨在研究ATRA與順鉑聯合應用于人頭頸癌TCA8113細胞的協同抑癌作用。

1　材料與方法

1.1材料順鉑(南京制藥廠有限公司)用去離子水配制成1 mg·mL-1溶液，過濾除菌，4 ℃冷藏貯存。ATRA(美國Sigma公司)避光下用無水乙醇配制成10-2mol·L-1，過濾除菌，-20 ℃冰箱避光貯存備用。MTT(美國Sigma公司)用PBS液配制成5 mg·mL-1，過濾除菌，4 ℃冰箱貯存備用。TCA8113細胞由上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院提供。

1.2方法

1.2.1細胞培養細胞在37 ℃、體積分數5% CO2、飽和濕度培養箱中培養。

1.2.2MTT檢測分為4組：對照組(1 mL·L-1的無水乙醇)、ATRA組(10-5mol·L-1)、順鉑組(70 mg·L-1)和聯合組(ATRA終濃度為10-5mol·L-1，順鉑終濃度為70 mg·L-1)。用胰蛋白酶消化對數生長期的細胞，制成單細胞懸液，以5 000個/孔接種于96孔板，每組細胞設4個復孔。連續培養6 d，每隔24 h去除上清，加入20 μL 5.0 mg·mL-1濃度的MTT溶液，繼續培養4 h。吸去上清，加入200 μL二甲基亞砜。震蕩10 min，酶聯免疫標記儀設定波長為490 nm，檢測各孔光密度(OD)值。實驗重復3次。繪制細胞生長曲線。

1.2.3流式細胞儀檢測收集細胞1×106·mL-1，預冷PBS洗2次。用PBS稀釋乙醇至70%濃度，加入1 mL，4 ℃過夜固定。PBS洗1次，棄盡液相。加入400 μL PI/RNase Staining Buffer,避光孵育15 min。流式細胞儀檢測，使用488 nm激發光，Cellquest軟件收細胞至10 000個，ModFitLT軟件分析細胞周期。

1.2.4Western blot檢測收獲指數生長期細胞的蛋白，測定蛋白濃度。配制質量分數10%分離膠聚丙烯酰胺凝膠，轉膜使用電流300 mA，2 h，質量分數5%脫脂奶粉封閉4 ℃過夜，D2-40和β-actin一抗在搖床孵育4 h。二抗孵育1 h，化學發光Western blot分析試劑盒：ECL Plus Western blot檢測試劑盒(英國Amersham公司),實驗重復3次。

2　結果

2.1細胞形態學變化顯微鏡下觀察可見24 h時對照組腫瘤細胞生長良好，呈多邊形，胞體透亮；ATRA作用組細胞在24 h時細胞攣縮成圓形，胞內顆粒增多；48 h時，實驗組大量細胞呈圓形懸浮狀態，少量細胞貼壁生長，部分細胞斷裂成碎片；72 h時，實驗組大量細胞呈漂浮狀態，大量細胞裂解并碎片形成。

2.2順鉑、ATRA對TCA8113細胞的生長抑制作用MTT法測定細胞增殖活性：ATRA可以抑制TCA8113細胞增殖活性，在48 h時抑制最為明顯；與順鉑聯用后增殖活性明顯降低(P<0.05)。到第6天，細胞生長進入平臺期。見圖1。

圖1　ATRA及順鉑對TCA8113細胞增殖活性的抑制作用

2.3ATRA及順鉑對TCA8113細胞周期及細胞凋亡的影響流式細胞儀檢測顯示： 對照組細胞處于G2/M期比例明顯高于藥物處理組；藥物聯用后出現G0/G1期和G2/M期阻滯，明顯促進TCA8113細胞凋亡(P<0.05)。見表1。

2.4ATRA及順鉑作用于TCA8113細胞后對細胞凋亡蛋白caspase-3表達的影響Western blot實驗顯示ATRA及聯合用藥作用于細胞后可見caspase-3總蛋白明顯減少，說明處于功能激活狀態的caspase-3剪切體增多，進而說明ATRA及聯合用藥組抑癌作用的機制是通過誘導細胞凋亡發揮抗腫瘤作用。見圖2。

圖2　ATRA及順鉑對TCA8113細胞caspase-3表達的影響

組別G0/G1SG2/M細胞凋亡率/%對照組45.37±1.9848.41±3.146.22±1.666.77±1.27ATRA組54.44±2.6933.31±3.461)12.25±2.0119.50±2.041)順鉑組40.31±0.7636.80±1.751)22.89±1.761)23.43±3.221)聯合組48.78±2.481)3)32.75±1.641)3)18.47±2.221)2)33.78±2.211)2)3)

注：與對照組比較，1)P<0.05；與ATRA組比較，2)P<0.05；與順鉑組比較，3)P<0.05。

3　討論

文獻報道很多抗腫瘤藥物是通過誘導腫瘤細胞凋亡來發揮作用的，ATRA是一種的分化誘導劑，在腫瘤細胞生長、分化中發揮重要作用，研究提示其能誘導多種腫瘤細胞凋亡，在多種惡性腫瘤如白血病、甲狀腺癌、肝癌、大腸癌等起到重要抗腫瘤作用[2-7]。增殖活性是細胞生物學特性的基本參數之一，本結果提示ATRA組的增殖活性抑制在48 h和72 h較對照組明顯增強，說明ATRA對TCA8113細胞有明顯增殖活性抑制作用。在本實驗中觀察到藥物聯合組的抑制率與單藥相比，72 h時協同抑制增殖活性明顯，這表明ATRA與順鉑聯合用藥具有協同抑癌作用。

細胞周期的調控在腫瘤的發生中有著重要的作用[4]，細胞增殖和凋亡調節失控對腫瘤生物學行為有著重要的影響，研究表明ATRA對腫瘤細胞可以產生G1期阻滯[8]，而高濃度的順鉑可導致腫瘤細胞出現G2/M期阻滯[9]。本實驗中發現ATRA作用于TCA8113細胞后,G0/G1期的細胞比增加，S期的腫瘤細胞比率下降,而ATRA聯合順鉑用藥作用于TCA8113細胞后G0/G1期和G2/M期腫瘤細胞比率均增加，說明聯合用藥后TCA8113細胞DNA合成和有絲分裂受阻。單一用藥作用于TCA8113細胞后發現各組的凋亡率與對照組比較差異均有統計學意義，聯合用藥與ATRA組、順鉑組相比，凋亡率明顯提高。

本研究對用藥后凋亡率提高的機制進行進一步研究，caspase-3的激活通常被作為細胞凋亡的一個重要指標，其是細胞凋亡過程中的關鍵的執行分子[10]。Caspase-3的激活需要從沒有活性的全長(85 000)被剪切成具有活性亞基。本實驗中通過檢測發現，ATRA及聯合組作用于腫瘤細胞后caspase-3全長表達量明顯下降，說明了caspase-3功能亞基的增多，證實了ATRA及聯合組通過誘導TCA8113細胞的凋亡是其發揮抗腫瘤作用的機制之一。

本實驗說明ATRA能調節人頭頸鱗癌TCA8113細胞周期，并發揮誘導細胞凋亡的作用，與順鉑聯合用藥后可協同發揮誘導人頭頸鱗癌TCA8113細胞的凋亡。這為今后腫瘤化療藥物的聯合應用提供里理論依據。

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Effect of All-trans Retinoic Acid Compared with Cisplatin in Inducing Apoptosis of TCA8113 Cell Lines

Sun Qiang1,2,Qiu Feng1,Zhao Junfang1,Fang Zheng1,Li Xinming1,Sun Minglei1

(1.DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China;2.InstituteofClinicalMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

國家自然科學基金資助項目(編號：81402231)；河南省科技廳基礎研究和前沿技術研究項目(編號：142300410315)；鄭州市口腔頜面外科院士工作站資助項目(編號：152PYSGZ040)；鄭州大學第一附屬醫院院內青年基金項目

孫強(1985-)，男，博士，主治醫師，主要從事口腔頜面外科基礎與臨床工作。E-mail：85244275@qq.com

孫明磊(1973-)，男，博士，主任醫師，主要從事口腔頜面外科基礎與臨床工作。E-mail：sunmlsuccess@sina.com

10.3969/j.issn.1673-5412.2016.04.002

R739.8；R730.23

A

1673-5412(2016)04-0281-03

2016-07-23)