血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在肝癌血管內(nèi)皮細(xì)胞體外管腔形成中量效和時(shí)效局限性的實(shí)驗(yàn)研究

趙文靜，錢紅燕，李　靖，張素青，邵冰鋒，張一心，陳建國(guó)，楊俐萍

(1.南通大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南通 226361；2.南通大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院外科，江蘇 南通 226361；3.啟東肝癌防治研究所，江蘇 南通 226200)

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血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在肝癌血管內(nèi)皮細(xì)胞體外管腔形成中量效和時(shí)效局限性的實(shí)驗(yàn)研究

趙文靜1，錢紅燕1，李靖1，張素青2，邵冰鋒2，張一心2，陳建國(guó)3，楊俐萍1

(1.南通大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南通 226361；2.南通大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院外科，江蘇 南通 226361；3.啟東肝癌防治研究所，江蘇 南通 226200)

目的利用體外管腔形成模型，研究血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)對(duì)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞(TECs)調(diào)控的精準(zhǔn)性，探討以VEGF為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物在臨床應(yīng)用中出現(xiàn)缺陷的潛在機(jī)制。方法采用CD31免疫磁珠分選人肝癌標(biāo)本中的TECs，在含Matrigel基質(zhì)膠的96孔板中,分別與不同濃度VEGF共培養(yǎng)，觀察不同時(shí)間的TECs體外管腔形成能力，以正常人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)為對(duì)照。結(jié)果1)體外分離培養(yǎng)的TECs擬血管內(nèi)皮細(xì)胞梭狀形態(tài)，其96%的細(xì)胞表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記CD31；2)TECs在微小量(基礎(chǔ)培養(yǎng)條件，2 ng·mL-1)VEGF165時(shí)，體外管腔形成較少或不成腔，而對(duì)照組HUVECs卻能形成明顯的管腔并分支成網(wǎng)；當(dāng)附加10 ng·mL-1VEGF165時(shí)，在4 h觀察到TECs如同HUVECs形成了管腔，在6 h出現(xiàn)明顯的分支網(wǎng);然而，當(dāng)附加20 ng·mL-1VEGF165時(shí)，在6 h觀察到TECs形成的管腔明顯減少；統(tǒng)計(jì)分析顯示，10 ng·mL-1VEGF165組TECs成管能力比2 ng·mL-1VEGF165組高出6倍(P<0.001)，而20 ng·mL-1VEGF165組TECs成管能力顯著下降至10 ng·mL-1VEGF165組的4.5倍(P<0.001)；3)10 ng·mL-1VEGF165組在培養(yǎng)4、6、8 h均可見(jiàn)TECs管腔形成，但以6 h為顯著；在20 h時(shí)，TECs的管腔消失，而對(duì)照組HUVECs卻還有明顯的管腔分支網(wǎng)。結(jié)論肝癌TECs體外管腔形成對(duì)VEGF165既有依賴性但又有量-效局限性，過(guò)高VEGF濃度能抑制性影響TECs(而不是HUVECs)管腔形成能力。在VEGF的刺激下，TECs體外管腔形成的時(shí)效性短于HUVECs。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，臨床應(yīng)用抗VEGF的抗腫瘤藥物療效不一可能與VEGF在TECs體外管腔形成的量效和時(shí)效的局限性有關(guān)。

腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞；腫瘤血管生成；體外管腔形成；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

[Abstract]ObjectiveBased on tube formation model in vitro, to investigate the effects of vascular endothelial growth factor (VEGF) with dose- and time- dependent on the tube formation of tumor-derived endothelial cells (TECs), and to analyze the potential mechanism by which poor outcome of VEGF-target anticancer drug in the clinical application.MethodsIsolation of tumor endothelial cells (TECs, CD31 positive cells) were treated by using CD31- magnetic beadsfrom surgery tumor tissues of the liver cancer patients. Isolated TECs were co-cultured with different concentrations of VEGF165 on the matrigel in the 96-well plates. The tube formation with different concentration of VEGF at several time points was evaluated, respectively. Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were served as the normal control.Results1) TECs appeared spindle shape under the culture among which 96% of the cells were CD31 positive、CD31 a pan marker of endothelial cells; 2) TECs nearly did not occur tube formation under co-culture with the basic condition containing 2 ng·mL-1VEGF165, while HUVECs showed the capillary tubule-1ike formation as well as a lot of branches. When 10 ng·mL-1VEGF165 was added in the culture, at 4 h TECs alike HUVECs appeared the tube formation that was at 6 h increased by 6 folds comparing to the basic condition culture (P<0.001). Interestingly, when 20 ng·mL-1VEGF165 were added in the culture, at 6 h, TECs occurred a little tube formation that was decreased by 4.5 folds comparing to the co-culture with 10 ng·mL-1VEGF165 (P<0.001). 3) When TECs were co-culture with 10 ng·mL-1VEGF165, tube formation showed at 4 h, 6 h, 8 h at which time point the tube formation in fact appeared reduction, and even disappeared at 20 h, while the clear tubes and branches were still existing in HUVECs control.ConclusionOur data demonstrate that the dose- and time- dependent effectiveness of VEGF on the tube formation of TECs from human liver cancer is limited. The higher concentration of VEGF may inhibit tube formation in vitro of TECs but not HUVECs. The time length of the tube formation is much shorter by TECs than by HUVECs. We proposal a potential mechanism by which poor outcome of VEGF-target anticancer drug in the clinical application may related to VEGF features as mentioned above.

[Key words]tumor endothelial cells; tumor angiogenesis; tube formation in vitro; vascular endothelial growth factor

正常人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)腫瘤血管在腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用。當(dāng)腫瘤直徑大于2 mm時(shí)，新生血管出現(xiàn)，為大量增殖的腫瘤細(xì)胞提供氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，最終導(dǎo)致腫瘤組織的增大以及腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。Folkman[1]首次提出通過(guò)阻斷腫瘤血管的生成可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移,引申出腫瘤“饑餓療法“的概念。因此，研究腫瘤血管的生物學(xué)特性以及發(fā)生的機(jī)制對(duì)惡性腫瘤的生長(zhǎng)、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移以及臨床治療具有重要的價(jià)值。

血管生成受促進(jìn)與抑制因子2個(gè)方面調(diào)控。在促血管生成的因子中，最為關(guān)注的是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)。VEGF與其血管細(xì)胞上的受體結(jié)合，引起細(xì)胞分裂、增殖及遷移，從而在腫瘤組織中出現(xiàn)新生血管生成，以滿足腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需要。因此VEGF及其受體在腫瘤血管生成過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[2]。VEGF是一個(gè)多成員的家族，包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E以及胎盤生長(zhǎng)因子等，其中VEGF-A對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有特異性的作用。VEGF-A家族經(jīng)剪接后有5種不同的單體，根據(jù)氨基酸的數(shù)目分別命名為VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189、VEGF206，其中VEGF165是分泌性蛋白質(zhì)，能與內(nèi)皮細(xì)胞上的VEGFR2結(jié)合。由于cDNA擴(kuò)增豐度中以VEGF165最高,所以VEGF165是實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用最多的一種VEGF單體[3]。VEGF-A通過(guò)結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞膜上的2個(gè)受體酪氨酸激酶,即VEGFR1和VEGFR2，主要是VEGFR2介導(dǎo)發(fā)揮作用[4]。受體VEGFR2激活時(shí)觸發(fā)幾個(gè)信號(hào)通路激活,包括磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/AKt,以及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的級(jí)聯(lián)途徑[5]。

值得一提的是，盡管VEGF及其受體作用的研究已很多，并且以VEGF及其受體為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物貝伐單抗已在臨床上廣泛應(yīng)用。然而，既往的實(shí)驗(yàn)性研究大多是正常情況下觀察VEGF對(duì)在體血管通透性的改變以及離體血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡等方面的作用[6]，而對(duì)VEGF在腫瘤來(lái)源的血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)行為的影響以及后者對(duì)VEGF反應(yīng)的特征，迄今為止尚未有報(bào)道。體外血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)特性的改變可以通過(guò)管腔形成模型、劃痕遷移等來(lái)檢測(cè)[6]，利用這些模型深入研究VEGF對(duì)血管(尤其是腫瘤血管)的作用以及特征，無(wú)疑對(duì)更進(jìn)一步地完善VEGF作用的研究有極大的價(jià)值。

組織形態(tài)和整體功能的研究表明，腫瘤血管與正常血管是不同的。從形態(tài)上看，腫瘤血管表現(xiàn)為異型分支、不完整內(nèi)皮、缺乏功能平滑肌，從功能上，腫瘤血管通透性明顯增高，這些特征被描述為腫瘤微血管構(gòu)筑表型異質(zhì)性[7]。因此，既往基于正常血管內(nèi)皮細(xì)胞的研究結(jié)果所得出來(lái)的關(guān)于異常血管調(diào)節(jié)的結(jié)論顯然是不精準(zhǔn)的。利用分離純化腫瘤組織中的血管內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)研究VEGF的作用，將對(duì)已“既定”的理論提供“校正”是很有必要的。同時(shí)，也為解釋臨床上應(yīng)用血管靶向抗腫瘤藥物出現(xiàn)療效不一而找到可能的原因和機(jī)制。

目前對(duì)在體外VEGF對(duì)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞(tumor-drived endothelial cells，TECs)的生物學(xué)行為的作用及其特性尚不完全明了。本研究采用從肝癌提取并純化TECs，結(jié)合血管內(nèi)皮細(xì)胞體外管腔形成模型，觀察TECs管腔形成對(duì)VEGF依賴性的特征，進(jìn)一步探索VEGF功能的本質(zhì)，為闡明VEGF對(duì)腫瘤血管生成以及調(diào)控提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，為臨床靶向血管抗腫瘤藥物的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1　資料與方法

1.1腫瘤標(biāo)本及單細(xì)胞懸液的制備標(biāo)本來(lái)自南通市腫瘤醫(yī)院肝癌手術(shù)切除的新鮮組織，并經(jīng)過(guò)患者簽訂知情同意書和醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)獲準(zhǔn)。將切除的肝癌標(biāo)本立即放入20 mL預(yù)冷PBS(含體積分?jǐn)?shù)5%胎牛血清、質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%青鏈霉素雙抗)的試管中。漂洗組織塊中的組織液和血細(xì)胞后移至培養(yǎng)皿中剪切成1～2 mm3碎塊。移入10 mL 預(yù)熱的質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5% Ⅰ、Ⅳ型膠原酶混合Hank’s溶液中終止消化后，用不機(jī)械研磨，用70 μm細(xì)胞濾器過(guò)濾細(xì)胞懸液，在單細(xì)胞懸液中加入DNase酶，以防止細(xì)胞黏成團(tuán)，計(jì)數(shù)。

1.2免疫磁珠分選每60 μL(1×106個(gè))細(xì)胞懸液加入40 μL CD31免疫磁珠混合液(德國(guó)Miltenyi Biotech公司)，置于旋轉(zhuǎn)混勻機(jī)，4 ℃孵育20 min；將LS Column裝在磁珠鐵架磁性區(qū)上，磁柱中加入3 mL的抽氣PBS,沖洗濕潤(rùn)，排除磁柱中的空氣，將待分選的細(xì)胞加入過(guò)柱，收集通過(guò)磁柱的CD31陰性細(xì)胞，用3 mL PBS洗滌柱子3次，將柱子移出磁鐵并置于15 mL試管，用柱芯壓出積存在柱子里的CD31陽(yáng)性細(xì)胞，4 ℃，1 000 r·min-1，離心8 min，棄去上清，進(jìn)行培養(yǎng)流程。

1.3原代培養(yǎng)將TECs放入基礎(chǔ)培養(yǎng)條件中，即含體積分?jǐn)?shù)5%胎牛血清，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%青霉素、鏈霉素，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑(其成分含2 ng·mL-1VEGF)的內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基(美國(guó)ScienCell公司)，移至T25培養(yǎng)瓶，置于37 ℃、質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.4流式細(xì)胞儀分析當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞擴(kuò)增至80%的融合度，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.025%胰酶消化，收集細(xì)胞放入試管中，用PBS清洗，應(yīng)用熒光PE標(biāo)記的CD31抗體(美國(guó)BD公司，克隆：WM59)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，4 ℃孵育20 min，清洗(3 000 r·min-1、4 ℃離心4 min)，棄去上清，PBS重懸并加入到流式管，BD FACSAriaⅡ流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)分析。

1.6體外管腔形成Matrigel膠(美國(guó)Corning公司)4 ℃過(guò)夜溶解，預(yù)先冷卻96孔板和移液槍頭，冰上操作，4 ℃環(huán)境下96孔板每孔加入50 μL膠，置于37 ℃孵育30 min。每孔加入4×104個(gè)細(xì)胞，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2孵箱中培養(yǎng)，分別于4 h、6 h、8 h、20 h顯微鏡下觀察成管現(xiàn)象。以Image Pro Plus 6.0軟件分析管腔形成差別。

2　結(jié)果

2.1肝癌TECs體外培養(yǎng)及鑒定光學(xué)顯微鏡拍攝不同來(lái)源的血管內(nèi)皮細(xì)胞即新鮮肝癌組織標(biāo)本的血管內(nèi)皮細(xì)胞和正常血管內(nèi)皮細(xì)胞。HUVECs呈典型鋪路石形態(tài)，肝癌組織提取的TECs呈長(zhǎng)梭形、鋪路石狀及不規(guī)則等多種形態(tài)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示有96% TECs表達(dá)CD31，熒光顯微鏡分析顯示幾乎所有TECs呈紅色熒光標(biāo)記的CD31陽(yáng)性細(xì)胞，與藍(lán)色DAPI標(biāo)記細(xì)胞核重合時(shí)，可見(jiàn)CD31表達(dá)定位于細(xì)胞膜，提示所分離出來(lái)的細(xì)胞有血管內(nèi)皮細(xì)胞的表型，并且純度很高。見(jiàn)圖1。

2.2肝癌TECs體外管腔形成對(duì)VEGF的依賴性原代細(xì)胞經(jīng)傳代培養(yǎng)后與基質(zhì)膠(支撐作用)共培養(yǎng)，在基礎(chǔ)培養(yǎng)條件(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基)下，分別觀察4 h、6 h、8h、20 h時(shí)間點(diǎn)的毛細(xì)管腔樣的結(jié)構(gòu)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):TECs組在體外任何一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的管腔形成都很少或幾乎未見(jiàn)管腔；而有趣的是，在HUVECs組可見(jiàn)清晰的管腔形成并且排成網(wǎng)狀，從攝像開(kāi)始的4 h就出現(xiàn)管腔，6 h增加，管腔持續(xù)到20 h時(shí)仍能明顯見(jiàn)到。提示足以刺激HUVECs體外成管的微小劑量VEGF(2 ng·mL-1)對(duì)TECs成管不敏感。進(jìn)一步，當(dāng)在基礎(chǔ)培養(yǎng)條件下加入10 ng·mL-1VEGF165，發(fā)現(xiàn)TECs與HUVECs一樣都有管腔形成，但管腔纖細(xì)。這些發(fā)現(xiàn)提示了TECs體外管腔形成對(duì)VEGF的量存在依賴性，10 ng·mL-1VEGF可以促進(jìn)TECs體外成腔。

圖1　體外培養(yǎng)原代肝癌TECs及其表型鑒定

光學(xué)顯微鏡(×100)觀察培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)，A：HUVECs；B：原代培養(yǎng)肝癌TECs；C：流式細(xì)胞儀定量分析內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記CD31在TECs的表達(dá)；D、E、F：激光共聚焦顯微鏡(×400)分析TECs表面CD31的表達(dá)。紅色(Dylight-649)代表CD31，藍(lán)色(DAPI)示細(xì)胞核

圖2　TECs和HUVECs在基礎(chǔ)培養(yǎng)條件下的管腔形成

在基礎(chǔ)培養(yǎng)條件(含2 ng·mL-1VEGF165)下,分別在4 h、6 h、8 h、20 h用光學(xué)顯微鏡(×100)觀察TECs(A～D)及HUVECs(E～H)的管腔形成，其中TECs為第7～9代

2.3VEGF刺激TECs體外管腔形成的時(shí)效性當(dāng)在基礎(chǔ)培養(yǎng)條件下加入10 ng·mL-1VEGF165，發(fā)現(xiàn)TECs如同HUVECs，在觀察的時(shí)間4 h時(shí)就有管腔形成，6 h時(shí)管腔樣結(jié)構(gòu)增粗，呈完整網(wǎng)狀，然而在8 h時(shí)部分管腔萎縮，20 h時(shí)管腔樣結(jié)構(gòu)完全消失，聚集成細(xì)胞團(tuán)。而對(duì)照組HUVECs類似于在基本培養(yǎng)條件下的管腔形成，在4～8 h內(nèi)，管腔樣結(jié)構(gòu)越來(lái)越清晰并形成網(wǎng)狀，20 h時(shí)管腔結(jié)構(gòu)仍然清晰可見(jiàn)。這些結(jié)果提示，即便在一定量的VEGF存在下，TECs與HUVECs體外管腔形成在時(shí)間上也有區(qū)別，TECs形成的管腔持續(xù)時(shí)間短，在6 h觀察最佳，隨后逐漸萎縮消退,說(shuō)明TECs體外管腔形成對(duì)VEGF的依賴是有時(shí)效性的。

2.4VEGF刺激肝癌TEC管腔形成的量-效局限性在基礎(chǔ)培養(yǎng)條件中加入10 ng·mL-1VEGF165，發(fā)現(xiàn)TECs組出現(xiàn)管腔形成，由此是否認(rèn)為TECs的管腔與VEGF量存在量-效依賴關(guān)系，即隨藥物濃度的增加而管腔增多。將TECs分為3組不同濃度的VEGF培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在6 h時(shí)，基礎(chǔ)培養(yǎng)條件(VEGF 2 ng·mL-1)管腔形成極少；10 ng·mL-1VEGF165組的TECs成管明顯,并且管腔增多至對(duì)照組的6倍(P<0.001)；20 ng·mL-1VEGF165組出現(xiàn)管腔明顯減少，雖然該組比基礎(chǔ)培養(yǎng)條件組的成管略為增多，但是比10 ng·mL-1VEGF165組減少4.5倍(P<0.001)，提示，TECs成管形成不是隨VEGF濃度增加而增多，而存在量-效局限性關(guān)系，即TECs對(duì)微小濃度VEGF無(wú)效應(yīng)，相反對(duì)高濃度VEGF的效應(yīng)也減弱，在最適濃度為10 ng·mL-1的VEGF刺激下，在最佳時(shí)間6 h觀察到的管樣結(jié)構(gòu)最明顯。

圖3　TECs管腔形成對(duì)VEGF的依賴性及時(shí)效性

在基礎(chǔ)培養(yǎng)條件(含2 ng·mL-1VEGF165)附加10 ng·mL-1VEGF165情況下，分別在4 h、6 h、8 h、20 h用光學(xué)顯微鏡(×100)觀察TECs(A～D)及HUVECs(E～H)的管腔形成，其中TECs為第7～9代

圖4　不同濃度VEGF對(duì)TECs管腔形成的影響

在基礎(chǔ)培養(yǎng)條件(2 ng·mL-1VEGF165)(A)、基礎(chǔ)培養(yǎng)條件+ 10 ng·mL-1VEGF165(B)、基礎(chǔ)培養(yǎng)條件+20 ng·mL-1VEGF165(C)的原代TECs管腔形成以及各組比較的柱形統(tǒng)計(jì)圖(D)。采用光學(xué)顯微鏡觀察(×100)，其中TECs為第7～9代，fold表示對(duì)照組的倍率

3　討論

新生血管形成在惡性腫瘤生長(zhǎng)發(fā)展以及轉(zhuǎn)移中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤血管存在構(gòu)筑表型異質(zhì)性。此外還發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中腫瘤細(xì)胞自身形成管脈系統(tǒng)，被稱為擬態(tài)血管，即不依賴于內(nèi)皮細(xì)胞的增生而構(gòu)建擬血管壁結(jié)構(gòu)的管狀網(wǎng)絡(luò)形成模式[8]。由此可見(jiàn)，腫瘤血管與正常血管是有區(qū)別的，而既往對(duì)腫瘤血管生成過(guò)程和調(diào)控的理解是基于正常血管的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，這顯然是不精準(zhǔn)的。面對(duì)這個(gè)缺陷，首先是要解決TECs的分離提取問(wèn)題。CD31是一種介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞間黏附分子，對(duì)維持血管內(nèi)皮細(xì)胞間的連接及維持血管完整性具有重要作用[9]，因此CD31被認(rèn)為是血管內(nèi)皮細(xì)胞的泛標(biāo)記。我們采用CD31免疫磁珠分選技術(shù)，從血管豐富器官的肝臟癌組織中提取TECs并用流式細(xì)胞儀進(jìn)一步純化，通過(guò)形態(tài)學(xué)、表型以及功能進(jìn)行鑒定確認(rèn)。目前研究血管的生理和病理以及藥物作用的體外血管生成，通常是用基質(zhì)膠作半固體立體支撐，將觀察的細(xì)胞與基質(zhì)膠共培養(yǎng)，觀察細(xì)胞從單個(gè)狀態(tài)變成串珠樣管狀結(jié)構(gòu)的體外管腔形成模型，主要分為二維血管和三維血管的培養(yǎng)方式，二維血管指細(xì)胞在膠體表面上形成的管樣結(jié)構(gòu)，三維血管指細(xì)胞侵入膠體基質(zhì)形成的管樣結(jié)構(gòu)[10]。在觀察我們分離出來(lái)的肝癌TECs的生物學(xué)特性時(shí)，將HUVECs作平行對(duì)照，結(jié)果提示兩者確實(shí)有區(qū)別，例如在體外管腔形成的活性方面：在基礎(chǔ)培養(yǎng)條件20 h內(nèi)，HUVECs出現(xiàn)明顯的管腔形成，并且分支成網(wǎng)，而肝癌TECs的成腔很少或不能成腔。

腫瘤新生血管生成過(guò)程受局部微環(huán)境的影響，腫瘤微環(huán)境是由腫瘤細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、免疫細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)共同構(gòu)成[11]，其中細(xì)胞外基質(zhì)，包括促進(jìn)和抑制血管生成調(diào)節(jié)因子。血管生成促進(jìn)因子和血管生成抑制因子依照"開(kāi)關(guān)平衡假說(shuō)",對(duì)血管生成調(diào)控使之増生維持在一定生理范圍內(nèi)[12]。當(dāng)促血管因子增加和(或)抑制血管因子減少時(shí),將導(dǎo)致血管新生。促進(jìn)血管生成的因子主要為VEGF、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、血小板源性生長(zhǎng)因子、血管生成素，其中VEGF的促血管生成功能已得到公認(rèn)[13]。抑制因子有血管抑素、內(nèi)皮抑素、凝血酶蛋白-1等，其中內(nèi)皮抑素是一個(gè)有明顯抗腫瘤血管作用的內(nèi)源性血管形成抑制因子[14-15]。

VEGF家族中發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的主要成分是VEGF165,是VEGF-A中最豐富的異構(gòu)體,VEGF165高效特異作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞,能強(qiáng)烈促進(jìn)分裂并具有趨化作用,能增強(qiáng)微血管通透性,使得血漿纖維蛋白外滲,為血管形成過(guò)程中多種細(xì)胞遷移提供一個(gè)纖維網(wǎng)絡(luò)。可以直接刺激內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生增殖并產(chǎn)生纖維蛋白溶酶原激活劑和膠原酶,主要通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞上的特殊受體的作用,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞移動(dòng)和血管生成[16]。然而，既往對(duì)VEGF的研究沒(méi)有詳細(xì)闡述VEGF對(duì)腫瘤血管作用的精準(zhǔn)性。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TECs在體外管腔形成中對(duì)VEGF存在依賴性但又是量-效局限性，另外還有時(shí)效性等非線性的特點(diǎn)。在微小劑量(2 ng·mL-1)存在的基礎(chǔ)培養(yǎng)條件下，VEGF不足以促使TECs形成管腔，而附加10 ng·mL-1的VEGF165，在4 h時(shí)即可觀察到TECs出現(xiàn)較完整的管腔結(jié)構(gòu)，在6 h時(shí)管腔增粗，但從8 h起成管邊緣毛糙，萎縮，至20 h則完全消失。這些現(xiàn)象說(shuō)明，腫瘤血管體外成管對(duì)VEGF的依賴性，而且腫瘤血管生成需要高于正常劑量的VEGF存在。有趣的是，當(dāng)細(xì)胞在基質(zhì)膠培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，TECs的成管逐漸減少至消失，而HUVECs仍能見(jiàn)明顯的管腔形成，提示VEGF在TECs體外成管的作用是有時(shí)效性的特點(diǎn)，這很可能是VEGF由于代謝使局部有效濃度降低，不足以刺激管腔形成。值得一提的是，雖然TECs對(duì)VEGF存在依賴性，但當(dāng)增加VEGF濃度時(shí)，TECs管腔形成反而減弱，提示管腔形成效率并非隨著VEGF濃度的增加而增強(qiáng)，而存在VEGF效應(yīng)的最適濃度，對(duì)此我們提出“VEGF與管腔形成效應(yīng)的量-效局限性”假說(shuō)。這個(gè)現(xiàn)象存在的可能機(jī)制是，高濃度的外源VEGF影響了VEGF與VEGFR2結(jié)合的親和力。有資料報(bào)道，加入外源性的50 ng·mL-1的VEGF-A能夠顯著抑制VEGFR2的表達(dá)，并且兩者結(jié)合親和力降低，致使VEGFR-2及其下游信號(hào)通路的活化受到抑制，導(dǎo)致了內(nèi)皮細(xì)胞的分化、增殖、遷移和毛細(xì)血管管腔的形成受阻[17-18]。

綜上所述，VEGF是TECs體外管腔形成必不可少的細(xì)胞因子，然而兩者的關(guān)系并非呈簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。當(dāng)VEGF濃度偏低或偏高，基質(zhì)膠培養(yǎng)中的TECs都不能形成明顯的管腔和網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。在我們的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在基礎(chǔ)培養(yǎng)條件中附加10 ng·mL-1的VEGF165出現(xiàn)肝癌TECs成管的最佳狀態(tài)，但是當(dāng)增加1倍濃度時(shí)，管腔形成又受到抑制。對(duì)此，我們提出TECs的管腔形成是VEGF依賴性的，但又是量-效局限性的假說(shuō)。此外，在最適濃度VEGF存在下體外TECs管腔形成的時(shí)效性遠(yuǎn)遠(yuǎn)短于HUVECs。歸納VEGF的這些特征，我們引申出一些VEGF應(yīng)用的問(wèn)題:臨床上應(yīng)用VEGF分子靶向抗血管生成的抗腫瘤藥物常出現(xiàn)療效不一是否與VEGF的最適濃度相關(guān)，也就是說(shuō)，由正常血管研究出來(lái)的血管靶向藥物可能存在劑量不足，不能夠完全阻斷VEGF的作用。同時(shí)我們也推測(cè)，體內(nèi)腫瘤血管生成是在腫瘤微環(huán)境持續(xù)性地釋放促血管生成因子作用下發(fā)生，其過(guò)程遠(yuǎn)比體外實(shí)驗(yàn)復(fù)雜得多，因此，我們需要把VEFG對(duì)體外TECs成管的特殊關(guān)系在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中加以證實(shí)。

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Effect of Vascular Endothelial Growth Factor with a Dose- and Time-effectiveness Limitation on Angiogenesis in Vitro of Tumor Endothelial Cells Derived from Human Liver Cancer

Zhao Wenjing1，Qian Hongyan1, Li Jing1, Zhang Suqing2, Shao Bingfeng2, Zhang Yixin2, Chen Jianguo3, Yang Liping1

(1.KeyLaboratoryofCancerResearchCenter,theAffiliatedTumorHospitalofNantongUniversity,Nantong226361,China;2.DepartmentofSurgery,theAffiliatedTumorHospitalofNantongUniversity,Nantong226361,China;3.QidongLiverCancerInstitute,Nantong226200,China)

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(編號(hào)：81272378)；南通市應(yīng)用研究計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：BK2014036); 南通市衛(wèi)計(jì)委青年基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：WQ2014048)

趙文靜(1987-)，女，碩士，主要從事腫瘤血管生成相關(guān)研究。E-mail: wenjingvivian@163.com

楊俐萍(1958-)，博士，教授，主要從事腫瘤血管生成相關(guān)研究。E-mail: Liping.yang@ntu.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-5412.2016.04.003

R735.7；R730.23

A

1673-5412(2016)04-0284-07

2016-03-23)