食管鱗癌組織中GRIM-19的表達及意義

王建君，孫淼淼，張紅新，陳奎生

(1.鄭州大學第一附屬醫(yī)院病理科、河南省腫瘤病理重點實驗室，河南 鄭州 450052；2.鄭州人民醫(yī)院病理科，河南 鄭州 450000；3.河南省腫瘤醫(yī)院病理科，河南 鄭州 450008)

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食管鱗癌組織中GRIM-19的表達及意義

王建君1，2，孫淼淼3，張紅新1，陳奎生1

(1.鄭州大學第一附屬醫(yī)院病理科、河南省腫瘤病理重點實驗室，河南 鄭州 450052；2.鄭州人民醫(yī)院病理科，河南 鄭州 450000；3.河南省腫瘤醫(yī)院病理科，河南 鄭州 450008)

目的探討干擾素/維甲酸聯(lián)合應用誘導細胞凋亡相關基因(GRIM-19)在食管鱗癌組織中的表達及意義。方法采用免疫組化S-P法檢測50例食管鱗癌組織、50例正常食管黏膜組織、30例癌旁不典型增生組織中GRIM-19蛋白表達；應用原位雜交法檢測50例食管鱗癌組織、50例正常的食管黏膜組織、30例癌旁不典型增生的組織中GRIM-19 mRNA的表達。結果GRIM-19蛋白、mRNA在食管鱗癌組織中陽性表達率明顯低于癌旁不典型增生組織以及正常的食管黏膜組織，三者比較差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。GRIM-19蛋白、mRNA的陽性表達率與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移均有關(P均<0.05)，而與患者的性別、年齡均無關(P均>0.05)。結論GRIM-19表達與食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展有關，其表達的降低可能促進食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展。

食管鱗癌；干擾素/維甲酸聯(lián)合應用誘導細胞凋亡相關基因；免疫組化；原位雜交

[Abstract]ObjectiveTo investigate the expressions and clinical significances of gene associated with retinoid-interferon-induced mortality 19(GRIM-19) protein and mRNA in the esophageal squamous cell carcinoma tissues.MethodsThe expressions of GRIM-19 protein and mRNA in the 50 cases of esophageal squamous cell carcinoma tissues,50 cases of normal esophageal mucosa tissues and 30 cases of adjacent atypical hyperplasia tissues were de-tected by immunohistochemistry and in situ hybridization methods.ResultsThe expression of GRIM-19 protein and mRNA in the esophageal squamous carcinoma tissues were significantly lower than those of the atypical hyperplasia tissue adjacent to carcinoma and the normal esophageal mucosa(P<0.05).The GRIM-19 protein and mRNA positive expression rates were associated with tumor infiltration depth and lymph node metastasis(P<0.05),and had nothing to do with the age and gender(P>0.05).ConclusionThe GRIM-19 lower expression may be related to the occurrence and development of esophageal squamous carcinoma.

[Key words]esophageal squamous cell carcinoma; gene associated with retinoid-interferon-induced mortality 19; immunohistochemistry; in situ hybridization

干擾素/維甲酸聯(lián)合應用誘導細胞凋亡相關基因19(gene associated with retinoid-interferon-induced mortality 19，GRIM-19)是NADH脫氫酶I的亞單位，在線粒體的呼吸過程中發(fā)揮著重要作用[1]，其在正常組織中表達，但在腫瘤組織中卻呈現(xiàn)出不同程度的異常表達。研究[2-3]表明，GRIM-19是一種新的與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、凋亡等有關的基因。有關GRIM-19表達與食管癌發(fā)生、發(fā)展的關系研究尚未見文獻報道，本研究采用免疫組化S-P法檢測50例食管鱗癌組織、50例正常食管黏膜組織、30例癌旁不典型增生組織中GRIM-19蛋白的表達，應用原位雜交法檢測50例食管鱗癌組織、50例正常食管黏膜組織、30例癌旁不典型增生組織中GRIM-19 mRNA的表達，探討GRIM-19表達與食管癌發(fā)生、發(fā)展的關系。

1　材料與方法

1.1材料50例食管鱗癌標本選取河南省腫瘤醫(yī)院病理科2013年1月至2013年12月手術切除的標本，所有被選擇的患者術前均未接受過放療、化療及其他相關治療，臨床資料完整，并由兩名以上經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)生診斷證實為食管鱗癌。每例標本分別取癌組織、癌旁組織以及正常食管黏膜組織(手術切緣/距癌組織邊緣4 cm以外的組織)。所取標本均經(jīng)質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛固定，經(jīng)常規(guī)脫水，采用石蠟包埋，進行連續(xù)切片，備用。50例食管鱗癌標本中，男26例，女24例；年齡34～79歲，中位年齡61歲，年齡≥60歲者30例，<60歲者20例；臨床分期根據(jù)2009年第7版國際抗癌聯(lián)盟食管癌的TNM分期標準進行評定，浸潤到黏膜下層或淺肌層者10例，浸潤到深肌層者12例，浸潤至全層或外膜者28例；伴有淋巴結轉移者25例，無淋巴結轉移者25例。

1.2主要試劑GRIM-19鼠抗人多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；5’端生物素標記GRIM-19探針(5’-GCGTCGAGGACTGTCGGG-3’)由上海生物工程有限公司設計并合成；S-P免疫組化通用試劑盒、SA-AP顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3免疫組化步驟染色步驟按照免疫組化S-P法試劑盒說明進行，高壓抗原修復，DAB顯色,蘇木素復染。采用已知陽性表達的組織切片作陽性對照；用0.01 mol·L-1PBS代替一抗作陰性對照。

1.4免疫組化結果判斷GRIM-19陽性產(chǎn)物定位于細胞漿，陽性染色為黃色或棕黃色。GRIM-19陽性表達標準，根據(jù)組織中陽性細胞所占的百分比以及陽性細胞的染色深度來進行綜合的評分。陽性細胞百分比評分：隨機選取10個視野，分別計數(shù)100個細胞。以陽性細胞比例≤10%為0分，>10%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～100%為3分。陽性細胞的染色深度評分：陽性細胞無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分。2項評分的乘積作為該標本的積分，≤2分為陰性，>2分為陽性。

1.5原位雜交步驟組織經(jīng)新鮮配制二甲苯脫蠟,梯度酒精脫水后,用新鮮配制的體積分數(shù)3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶；質(zhì)量分數(shù)3%檸檬酸新鮮配制蛋白酶消化標本DNA結合蛋白；滴加不含探針的預雜交液(42 ℃),預雜交4 h；滴加含探針的雜交液,42 ℃濕盒內(nèi)雜交12 h；滴加SA-AP 37 ℃,30 min,BCIP/NBT,避光顯色2～4 h。用已知GRIM-19 mRNA陽性表達的組織切片作為陽性對照，用不含探針的預雜交液孵育標本作為陰性對照。

1.6原位雜交結果判斷GRIM-19 mRNA陽性表達均主要存在于細胞漿中，呈藍紫色顆粒。GRIM-19 mRNA表達的結果判定：根據(jù)陽性細胞在組織中所占百分比以及染色的深度來綜合評分。陽性細胞百分比評分：陽性細胞百分率為隨機選取10個視野，計數(shù)100個細胞，≤10%陽性細胞記為0分，11%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%為3分。陽性細胞染色深度評分：無色為0分，淡紫藍色為1分，紫藍色為2分，深紫藍色為3分。以2項評分的乘積作為該標本的積分，≤2分為陰性，>2分為陽性。

1.7統(tǒng)計學處理采用SPSS 17.0處理實驗數(shù)據(jù)，率的比較采用χ2檢驗；等級資料的相關性分析采用Spearman等級相關分析，檢驗水準α=0.05。

2　結果

2.1GRIM-19蛋白在不同食管組織中的表達GRIM-19蛋白在食管鱗癌組織中的陽性表達率為20.00%(10/50)，癌旁不典型增生組織為76.67%(23/30)，正常食管黏膜組織為84.00%(42/50)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=12.13，P<0.05)。見圖1、表1。

圖1　GRIM-19蛋白在不同食管組織中的表達(S-P，×100)

組別n陽性陰性陽性表達率/%χ2P正常食管黏膜組織5042884.00癌旁不典型增生組織3023776.6712.130.034食管鱗癌組織50104020.00

2.2GRIM-19蛋白的表達與食管鱗癌患者臨床病理參數(shù)的關系GRIM-19蛋白的陽性表達率與食管鱗癌浸潤深度、淋巴結轉移均有關(P均<0.05)，而與患者的年齡、性別均無關(P均>0.05)。見表2。

2.3GRIM-19 mRNA在不同食管組織中的表達GRIM-19 mRNA在食管鱗癌組織中的陽性表達率為24.00%(12/50)，癌旁不典型增生組織為76.67%(23/30)，正常食管黏膜組織為88.00%(44/50)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=11.83，P<0.05)。見表圖2、表3。

2.4GRIM-19 mRNA的表達與食管鱗癌患者臨床病理參數(shù)的關系GRIM-19 mRNA的陽性表達率與食管鱗癌浸潤深度、淋巴結轉移均有關(P均<0.05)，而與患者年齡、性別均無關(P均>0.05)。見表4。

表2GRIM-19蛋白的表達與食管鱗癌患者臨床病理參數(shù)的關系

臨床病理參數(shù)nGRIM-19蛋白陽性陰性陽性表達率/%χ2P性別 男2671926.900.050.405 女2432112.50年齡/歲 ≥603042613.343.260.732 <602061430.00浸潤深度 淺肌層105550.00 深肌層123925.006.610.037 全層282267.10淋巴結轉移 有2532212.005.710.041 無2571828.00

圖2　GRIM-19 mRNA在不同食管組織中的表達(ISH，×200)

A：正常食管黏膜組織；B：癌旁不典型增生組織；C：食管鱗癌組織

表3GRIM-19 mRNA在不同食管組織中的表達

組別n陽性陰性陽性表達率/%χ2P正常食管黏膜組織5044688.00癌旁不典型增生組織3023776.6711.830.038食管鱗癌組織50123824.00

3　討論

GRIM-19定位于第19號染色體，主要在線粒體內(nèi)膜表達[4]。在多種正常組織(如心肌、肺臟、胸腺、骨骼肌、結腸)中均能檢測到GRIM-19表達[5]，通常是病毒癌基因結合的靶點。

研究[6-8]發(fā)現(xiàn)，GRIM-19基因的突變、蛋白表達降低或缺失發(fā)生在泌尿系統(tǒng)腫瘤、消化系統(tǒng)腫瘤等多種腫瘤組織中，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，并有可能成為基因治療的一個潛在靶點。另有研究[9]表明，GRIM-19在正常宮頸組織中高表達，在宮頸癌組織中的表達降低，其表達降低可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關系。研究[10-11]表明，GRIM-19表達可以抑制宮頸癌細胞的侵襲、促進細胞凋亡，可能是宮頸癌治療的新靶點，此外，在一些體內(nèi)實驗中，上調(diào)GRIM-19的表達可抑制腫瘤的生長和發(fā)展。下調(diào)GRIM-19的表達可促進腎腫瘤的生長和發(fā)育。但有關GRIM-19表達與食管癌發(fā)生、發(fā)展的關系研究尚未見文獻報道。

表4GRIM-19 mRNA的表達與食管鱗癌患者臨床病理參數(shù)的關系

臨床病理參數(shù)nGRIM-19mRNA陽性陰性陽性表達率/%χ2P性別 男2671926.920.070.078 女2451920.83年齡/歲 ≥603072323.330.060.089 <602051525.00浸潤深度 淺肌層104640.00 深肌層123925.006.440.045 全層2852317.86淋巴結轉移 有2552020.005.130.036 無2571828.00

本研究結果顯示，GRIM-19蛋白、mRNA在食管鱗癌組織中陽性表達率明顯低于癌旁不典型增生組織、正常食管黏膜組織(P<0.05)。GRIM-19蛋白、mRNA的陽性表達率與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移均有關(P均<0.05)，而與患者的性別、年齡均無關(P均>0.05)?？傊?，GRIM-19低表達可能與食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展有關，該研究結果為進一步探討食管癌發(fā)生、發(fā)展機制提供了理論依據(jù)。

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Expression and Signficance of GRIM-19 in the Esophageal Squamous Carcinoma Tissues

Wang Jianjun1,2,Sun Miaomiao3,Zhang Hongxin1,Chen Kuisheng1

(1.DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China；2.DepartmentofPathology,thePeople'sHospitalofZhengzhou,Zhengzhou450000,China；3.DepartmentofPathology,HenanTumorHospital,Zhengzhou450008,China)

河南省基礎與前沿技術研究計劃項目(編號：142300410076)

王建君(1984-)，女，碩士，醫(yī)師，主要從事腫瘤病理學研究。E-mail:173939918@ qq.com

陳奎生(1964-)，男，博士，教授，主要從事腫瘤病理學研究。E-mail:chenksh2002@163.com

10.3969/j.issn.1673-5412.2016.04.004

R735.1；R730.23

A

1673-5412(2016)04-0290-04

2016-01-13)