miR-206抑制SDF-1/CXCR4信號活化誘導的乳腺癌細胞遷移和增殖

葛　新，曹　章，呂鵬威，李靖若，谷元廷

(鄭州大學第一附屬醫院乳腺外科，河南 鄭州 450052)

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miR-206抑制SDF-1/CXCR4信號活化誘導的乳腺癌細胞遷移和增殖

葛新，曹章，呂鵬威，李靖若，谷元廷

(鄭州大學第一附屬醫院乳腺外科，河南 鄭州 450052)

目的研究miR-206在乳腺癌細胞中的作用及其機制。方法MDA-MB-231細胞分別轉染miRNA-NC和miR-206 mimic后，熒光顯微鏡觀察轉染效率。同時，細胞添加不同劑量(20 ng·mL-1和40 ng·mL-1)基質細胞衍生因子1(SDF-1)處理，利用Transwell法檢測細胞遷移，噻唑藍(MTT)法檢測細胞增殖，qRT-PCR法檢測細胞中CXC趨化因子受體4(CXCR4)mRNA表達水平，Western blot檢測細胞中CXCR4蛋白表達水平。結果miRNA-NC組和miR-206 mimic組細胞轉染效率分別為(83.4±6.3)%和(87.6±8.3)%。與對照組比較，SDF-1顯著促進細胞遷移和增殖(P<0.05)。miR-206 mimic轉染明顯抑制細胞遷移和增殖(P<0.05)。SDF-1處理促進細胞中CXCR4 mRNA和蛋白的表達水平(P<0.05)。miR-206 mimic轉染則抑制CXCR4蛋白表達水平(P<0.05)，但不影響CXCR4 mRNA表達(P>0.05)。結論miR-206通過抑制CXCR4表達拮抗SDF-1誘導乳腺癌細胞遷移和增殖作用。

miR-206；乳腺癌；基質細胞衍生因子-1；CXC趨化因子受體4；遷移；增殖

[Abstract]ObjectiveTo explore the role of miR-206 in the breast cancer cells as well as its mechanism.MethodsFollowing the transfection of miRNA-NC and miR-206 mimic into MDA-MB-231 cells,the transfection efficiency was observed with a fluorescent microscope.Meanwhile,these cells were conditioned with different doses(20 ng·mL-1and 40 ng·mL-1) of stromal-derived factor-1(SDF-1).Cell migration was evaluated by Transwell assay.Cell proliferation was determined by MTT assay.The mRNA expression of CXC chemokine receptor 4(CXCR4) was analyzed by qRT-PCR method.Protein expression of CXCR4 was analyzed by Western blot.ResultsThe transfection efficiency of the miRNA-NC group and the miR-206 mimic group was (83.4±6.3)% and (87.6±8.3)%.Compared with the control group,SDF-1 significantly promoted cancer cells migration and proliferation(P<0.05).Transfection of miR-206 mimic markedly inhibited cancer cells migration and proliferation(P<0.05).SDF-1 conditioning enhanced the mRNA and protein expression of CXCR4 in cancer cells(P<0.05).Transfection of miR-206 mimic constrained CXCR4 protein expression(P<0.05),but did not influence its mRNA expression(P>0.05).ConclusionmiR-206 counteracted the role of SDF-1 in inducing breast cancer cell migration and proliferation through regression of CXCR4 expression.

[Key words]miR-206; breast cancer; stromal-derived factor-1; CXC chemokine receptor 4; migration; proliferation

微小RNA(microRNAs，miRs)是一種進化上保守的、長度約為22個核苷酸的非編碼RNA，能夠通過序列互補的方式在轉錄后水平上調控基因的表達[1]。miR-206在多種惡性腫瘤中具有重要的腫瘤抑制作用，包括胃癌[2]、結直腸癌[3]和乳腺癌[4]等。miR-206能夠直接靶向抑制肌動蛋白結合蛋白基因的表達、重塑微絲形態、抑制三陰性乳腺癌細胞遷移[5]。我們前期研究[6]也發現miR-206可以直接靶向抑制PFKFB3分子，影響乳腺癌細胞糖酵解過程以及細胞增殖和遷移。基質細胞衍生因子(stromal-derived factor-1，SDF-1)，也稱為CXC趨化因子配體12，其跨膜信號由一個G蛋白偶聯受體CXC趨化因子受體4(CXC chemokine factor receptor 4，CXCR4)介導[7]，能激活細胞內多個信號通路，進而調控細胞內鈣通量、趨化、轉錄以及細胞存活[8]。國內有研究[9]發現三陰性乳腺癌組織中SDF-1和CXCR4的表達是患者預后的重要生物學指標。本研究擬通過研究miR-206對SDF-1作用下乳腺癌細胞行為的影響，旨在探索miR-206在乳腺癌臨床治療中的作用，為乳腺癌的生物治療提供實驗證據。

1　材料與方法

1.1實驗材料MDA-MB-231細胞購自于美國模式培養物保藏所；胎牛血清、DMEM培養基、Trizol試劑盒、噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜、硝酸纖維素膜購自大連寶生物公司；重組人SDF-1購自上海滬震生物科技有限公司；miRNA-NC和miR-206 mimic購自上海吉瑪制藥技術有限公司；Lipofectamine2000、DNA Engine OpticonTM2熒光檢測系統和DyNAmo SYBR Green qPCR 試劑盒購自美國Invitrogen公司；抗CXCR4單克隆抗體和酶標羊抗鼠二抗購自美國Sigma公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養與分組處理將MDA-MB-231細胞孵育于體積分數10%胎牛血清的DMEM培養基中，置于37 ℃恒溫、體積分數5% CO2的飽和濕度培養箱中培養。將細胞隨機分為對照組、SDF-1A組、SDF-1B組、miRNA-NC組、miR-206 mimic組。SDF-1A組和SDF-1B組細胞分別用20 ng·mL-1和40 ng·mL-1SDF-1處理12 h，對照組細胞用等體積的PBS處理，miRNA-NC組和miR-206 mimic組細胞分別轉染miRNA-NC和miR-206 mimic 24 h后，添加40 ng·mL-1SDF-1處理12 h。

1.2.2miR-206 mimic轉染miRNA-NC和miR-206 mimic干粉離心后配制成終濃度為20 mol·L-1的工作液鋪板，24 h內進行轉染，按照Lipofectamine2000說明書進行轉染，轉染6 h后換液，繼續培養24 h后熒光顯微鏡下觀察轉染效率。

1.2.3Transwell法檢測細胞遷移MDA-MB-231細胞轉染48 h后，用胰蛋白酶消化細胞，細胞計數3×105，轉移至Transwell上層小室中，每孔鋪200 μL細胞，加入200 μL無血清培養基。下層板孔中加入600 μL完全培養基，37 ℃、體積分數5% CO2培養箱中培養24 h，隨后取出小室用體積分數90%乙醇固定，質量分數0.1%結晶紫溶液染色，置于顯微鏡下觀察并拍照，隨機選取4個低倍視野(×100)進行細胞計數，并計算平均值。

1.2.4MTT法檢測細胞增殖收集對數生長期細胞，按每孔3×104個接種于96孔培養板。細胞達到80%融合時用于MTT實驗。MTT實驗檢測分別在細胞培養24 h、48 h、72 h、96 h 后進行。按實驗分組情況，每孔加入 20 μL MTT(5 mg·mL-1)后培養4 h。去掉上清，按照每孔150 μL加入二甲基亞砜。混勻后用酶標儀測定(測量波長為570 nm)。實驗重復3次，取平均數作為實驗結果。

1.2.5qRT-PCR檢測利用Trizol試劑盒提取培養細胞系總RNA，按照步驟反轉錄合成cDNA。查找Genbank序列設計并合成CXCR4基因引物序列，上游引物：5’-GGT GGT CTA TGT TGG CGT CT，下游引物： 5’-TGG AGT GTG ACA GCT TGG AG-3’。采用DNA Engine OpticonTM2熒光檢測系統和DyNAmo SYBR Green qPCR 試劑盒進行基因表達的測定。反應體系為25 μL，其中12.5 μL DyNAmo SYBR Green qPCR mix，0.5 μL 20 pmoL引物，2 μL cDNA模板(<10 ng·mL-1)。反應條件為：94 ℃預變性10 min，94 ℃ DNA變性20 s，引物在54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，36個循環，72 ℃后延伸10 min。熔解曲線的制作條件為65～95 ℃，每0.2 ℃停留1 s。目的基因和 β-actin基因的拷貝數分別根據產生的Ct值從各自的標準曲線獲得。取3次重復的平均值，靶基因的相對表達量的計算由目的基因的拷貝數除以β-actin的拷貝數。

2　結果

2.1miR-206轉染MDA-MB-231細胞情況miR-206 mimic及miRNA-NC轉染MDA-MB-231細胞后，熒光顯微鏡下可觀察到細胞內的熒光信號(圖1)，則視為轉染成功。通過細胞計數可得，miRNA-NC組和miR-206 mimic組轉染效率分別為(63.4±6.3)%和(67.6±8.3)%。

圖1　熒光顯微鏡觀察miRNA-NC和

2.2miR-206拮抗SDF-1誘導的乳腺癌細胞遷移情況與對照組細胞比較，20 ng·mL-1SDF-1(SDF-1A組)和40 ng·mL-1SDF-1(SDF-1B組)處理明顯促進腫瘤細胞體外遷移(P<0.05)；與SDF-1A組及SDF-1B組比較，miR-206 mimic+SDF-1處理顯著降低細胞遷移(P<0.05)，而miRNA-NC+SDF-1則無影響(P>0.05)。見圖2、3。

圖2　Transwell法檢測MDA-MB-231細胞的體外遷移

圖3　MDA-MB-231細胞體外遷移定量分析

與對照組比較，1)P<0.05；與SDF-1A組比較，2)P<0.05；與miRNA-NC比較，3)P<0.05

2.3miR-206拮抗SDF-1誘導的乳腺癌細胞增殖情況與對照組細胞比較，SDF-1A組和SDF-1B組細胞增殖速率顯著升高(P<0.05)；miR-206 mimic轉染后，細胞增殖速率降低(P<0.05)，而轉染miRNA-NC則不能改變細胞增殖速率(P>0.05)。見圖4。

圖4　MTT法檢測MDA-MB-231細胞增殖

與對照組比較，1)P<0.05；與SDF-1A組比較，2)P<0.05；與miRNA-NC比較，3)P<0.05

2.4miR-206對乳腺癌細胞CXCR4 mRNA表達的影響qRT-PCR法檢測各組細胞CXCR4 mRNA的表達，結果顯示，SDF-1A組和SDF-1B組細胞CXCR4 mRNA明顯高于未經處理的對照組細胞(P<0.05)；轉染miRNA-NC和miR-206 mimic對CXCR4 mRNA的表達無顯著影響(P>0.05)。見圖5。

2.5miR-206對乳腺癌細胞中CXCR4蛋白表達的影響Western blot檢測細胞CXCR4蛋白的表達，結果顯示，對照組細胞比較，SDF-1處理顯著促進MDA-MB-231細胞中CXCR4蛋白的表達(P<0.05)；但是，轉染miR-206 mimic顯著抑制細胞中CXCR4蛋白的表達(P<0.05)，轉染miRNA-NC則不能對CXCR4的表達產生顯著影響(P>0.05)。見圖6、7。

圖5　qRT-PCR技術檢測

與對照組比較，1)P<0.05；與SDF-1A組比較，2)P<0.05

圖6　Western blot檢測

圖7　CXCR4蛋白條帶定量分析

與對照組比較，1)P<0.05；與SDF-1A組比較，2)P<0.05；與miRNA-NC比較，3)P<0.05

3　討論

研究[10]顯示miRNA調控細胞內基因的表達，既可以作為乳腺癌促癌基因也可以作為抑癌基因。促癌miRNA在乳腺癌細胞中表達上調，并能夠抑制下游許多與腫瘤抑制相關的基因的表達，例如原肌球蛋白1、程序性細胞凋亡因子4、同源性磷酸酶-張力蛋白、和金屬蛋白酶組織抑制因子等[10]。相反，腫瘤抑制miRNA則可以靶向抑制促癌基因，當它們功能缺失時，則可能導致細胞癌變[10]。miR-206是一種抑癌基因，其表達下調與多種惡性腫瘤的發生相關，其中包括乳腺癌[11]、胃癌[12]等。因此，研究miR-206在乳腺癌細胞中的作用機制具有重要的臨床意義。本研究利用miRNA-NC和miR-206 mimic體外轉染MDA-MB-231乳腺癌細胞，熒光顯微鏡下觀察，轉染效率可分別達(63.4±6.3)%和(67.6±8.3)%，因此可用于下一步研究，探索miR-206對腫瘤細胞的表達調控。

趨化因子家族是結構上相關、具有4個保守半胱氨酸位點的趨化性細胞因子，能夠與7次跨膜的G蛋白偶聯受體結合[13]。SDF-1是最先發現的與發育相關的趨化因子，具有調控造血作用、心臟發生、血管形成和神經形成的功能[13]。近年來，研究[14]發現SDF-1在腫瘤疾病進展中具有重要作用，利用SDF-1處理小鼠乳腺癌細胞可顯著促進細胞增殖和遷移。本研究首先利用2個不同劑量的SDF-1處理MDA-MB-231細胞，Transwell實驗結果發現這2個劑量的SDF-1均可促進細胞遷移，且具有劑量依賴性，驗證了趨化因子SDF-1對乳腺癌細胞的作用。然而，當細胞轉染miR-206 mimic時，細胞遷移受到明顯抑制，而轉染miRNA-NC則不影響細胞遷移，說明了miR-206可以拮抗SDF-1誘導的遷移作用。本研究同時檢測了SDF-1對細胞增殖的影響。MTT實驗結果表明，2個劑量的SDF-1均可顯著促進細胞增殖，其中高劑量組作用最明顯。與轉染miRNA-NC比較，轉染miR-206 mimic后，細胞增殖速率顯著降低，說明了miR-206具有拮抗SDF-1誘導癌細胞增殖的作用。

CXCR4是趨化因子SDF-1的經典受體。SDF-1與CXCR4相互作用可活化下游多條信號轉導通路以及效應因子，從而介導細胞存活、增殖、趨化、遷移和粘附等細胞行為[15]。詹升華等[16]研究發現CXCR4表達于乳腺癌組織和乳腺癌細胞株中，SDF-1可有效促進乳腺癌細胞的體外增殖和遷移。通過查閱TargetScan數據庫發現CXCR4是miR-206的潛在靶分子之一。因此本研究猜測miR-206可能通過直接調控CXCR4的表達來影響其配體SDF-1的作用。利用qRT-PCR法檢測乳腺癌細胞中mRNA的表達，結果發現SDF-1處理可以顯著促進細胞中CXCR4 mRNA的表達；轉染miRNA-NC以及miR-206 mimic后，細胞中CXCR4 mRNA表達水平沒有明顯變化，說明miR-206不影響CXCR4的轉錄水平。隨后研究進一步利用Western blot法檢測細胞中CXCR4蛋白的表達。與mRNA水平類似，SDF-1可以提高乳腺癌細胞中CXCR4蛋白水平；然而轉染miR-206 mimic后，CXCR4蛋白的表達水平受到顯著抑制，轉染miRNA-NC則無此作用，說明了miR-206對CXCR4表達的調控發生在轉錄后水平。

綜上所述，本研究發現miR-206可通過抑制乳腺癌細胞中CXCR4的表達、拮抗SDF-1誘導的細胞增殖和遷移作用。本研究局限于體外實驗，在之后研究中需要更多的體內實驗和臨床數據證明miR-206通過CXCR4發揮腫瘤抑制作用，從而為乳腺癌的靶向治療提供實驗證據。

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MiR-206 Suppresses Breast Cancer Cell Migration and Proliferation Induced by SDF-1/CXCR4 Signaling

Ge Xin,Cao Zhang,Lv Pengwei,Li Jingruo,Gu Yuanting

(DepartmentofBreastSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

葛新(1981-)，女，博士，主治醫師，主要從事乳腺疾病基礎和臨床研究。E-mail：gexin1981@126.com

谷元廷(1965-)，男，博士，主任醫師，主要從事乳腺疾病基礎和臨床研究。E-mail：zzyuantinggu@126.com

10.3969/j.issn.1673-5412.2016.04.005

R737.9；R730.23

A

1673-5412(2016)04-0294-05

2016-07-06)