TUBB3、TYMS mRNA在進(jìn)展期食管胃交界部腺癌組織中的表達(dá)及與新輔助化療療效的關(guān)系

李守淼，韓　朋，張　偉，劉志強，萬云杰，李保中，張志忠

(1.安陽市腫瘤醫(yī)院外科，河南 安陽 455000；2.安陽市腫瘤醫(yī)院病理科，河南 安陽 455000)

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TUBB3、TYMS mRNA在進(jìn)展期食管胃交界部腺癌組織中的表達(dá)及與新輔助化療療效的關(guān)系

李守淼1，韓朋2，張偉1，劉志強1，萬云杰1，李保中1，張志忠1

(1.安陽市腫瘤醫(yī)院外科，河南 安陽 455000；2.安陽市腫瘤醫(yī)院病理科，河南 安陽 455000)

目的探討β-微管蛋白Ⅲ(TUBB3)和胸苷酸合成酶(TYMS)mRNA在進(jìn)展期食管胃交界部腺癌(AEGJ)組織中的表達(dá)情況及在XP方案新輔助化療療效預(yù)測中的價值。方法54例進(jìn)展期AEGJ患者均行XP方案化療，并評價療效。用分支DNA-液相芯片技術(shù)檢測TUBB3、TYMS mRNA的表達(dá)情況，分析各基因表達(dá)與化療療效的關(guān)系。結(jié)果54例患者新輔助化療有效率為48.15%。TUBB3、TYMS mRNA的低表達(dá)率分別18.52%%和25.93%；TUBB3、TYMS mRNA的表達(dá)與化療敏感性有關(guān)。結(jié)論TUBB3、TYMS mRNA低表達(dá)是XP方案新輔助化療敏感性的影響因素，兩者的表達(dá)情況可為AEGJ個體化新輔助化療方案的選擇提供有益的參考。

食管胃交界部腫瘤；新輔助化療；β-微管蛋白Ⅲ；胸苷酸合成酶

[Abstract]ObjectiveTo investigate the expressions of TUBB3,TYMS mRNA in the locally advanced adenocarcinoma of esophagogastric junction(AEGJ) and the relationship with efficacy of neoadjuvant chemotherapy.MethodsThe 54 patients with locally advanced AEGJ were given with XP neoadjuvant chemotherapy regimen,and the efficacy were evaluated.The expressions of TUBB3,TYMS mRNA were detected by multiplex branched-DNA liquid chip technology in all the patients before neoadjuvant chemotherapy.The relationship between various genes and chemotherapy efficacy was analyzed by univariate and logistic multivariate regression analyses.ResultsThe overall response rates was 48.15%.The low expression rate of TUBB3,TYMS mRNA in the locally advanced AEGJ was 18.52% and 25.93%.Low expressions of TUBB3,TYMS mRNA were seen as risk factors for drug-resistance.ConclusionLow expressions of TUBB3,TYMS mRNA are important factors for XP regimen insensitivity in the locally advanced AEGJ.They may provide an useful reference for designing individualized chemotherapeutic regimens for patients with locally advanced AEGJ.

[Key words]esophagogastric junction neoplasms; neoadjuvant chemotherapy； β-tubulin Ⅲ; thymidylate synthase

近年來食管胃交界部腺癌(adenocarcinoma of esophagogastric junction,AEGJ)的發(fā)病呈增長趨勢[1-2]。現(xiàn)已證實新輔助化療用于進(jìn)展期胃癌能提高手術(shù)切除率、減少術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、延長生存期[3]。但對于Siewert Ⅱ型食管胃交界部腺癌新輔助化療的療效針對性研究較少。尋找可靠的化療敏感性預(yù)測指標(biāo)、早期篩選出對化療應(yīng)答不敏感的患者、減少不必要的術(shù)前化療，已成為重要臨床課題之一[4-5]。針對于此，我們回顧性研究了β-微管蛋白Ⅲ(β-tubulin Ⅲ,TUBB3)和胸苷酸合成酶(thymidylate synthetase,TYMS) mRNA在進(jìn)展期AEGJ化療前活檢標(biāo)本中的表達(dá)，評價兩者表達(dá)情況在XP方案新輔助化療療效種的預(yù)測作用，為AEGJ的個體化治療提供重要的依據(jù)。

1　資料與方法

1.1臨床資料收集2012年6月至2015年9月在安陽市腫瘤醫(yī)院行新輔助化療并行基因檢測的54例進(jìn)展期Siewert Ⅱ型AEGJ患者，男39例，女15例；年齡34～70歲，中位年齡58歲；治療前臨床分期均為T3～4N1～3M0；術(shù)前病理類型：高-中分化腺癌4例，中分化腺癌11例，中-低分化腺癌14例，低分化腺癌21例，黏液腺癌2例，印戒細(xì)胞癌1例，黏液腺癌伴印戒細(xì)胞癌1例。分化良好型[6]21例，分化不良型33例。研究對象的選擇標(biāo)準(zhǔn)：1)胃鏡活檢病理確診為腺癌；2)排除遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；3)腹部增強CT顯示局部腫塊侵犯胃壁全層(T3或T4)或有區(qū)域淋巴結(jié)腫大；4)所有患者ECOG評分為0～2分，且無嚴(yán)重心、肺、肝、腎等臟器功能異常；5)無其他惡性腫瘤病史及放、化療史；6)簽署知情同意書，愿意接受術(shù)前化療及手術(shù)者。

1.2治療方案所有54例患者均行XP 3周方案新輔助化療：紫杉醇注射液175 mg·m-2，靜脈滴注2～3 h，第1天；卡培他濱膠囊1 000 mg·m-2，口服，2次/d，第1～14天。3周后重復(fù)，共2次。化療同時予以地塞米松、西米替丁、格拉司瓊、苯海拉明等輔助用藥治療。化療結(jié)束后4周進(jìn)行術(shù)前療效評價，若無腫瘤進(jìn)展則行標(biāo)準(zhǔn)根治術(shù)(D2)，術(shù)后給予常規(guī)輔助化療。根據(jù)2010年美國癌癥聯(lián)合會(american joint committee on cancer,AJCC)第7版TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[7]進(jìn)行術(shù)后病理分期，其中Ⅱ期18例、Ⅲ期34例(1例大體觀腫瘤消失，鏡下僅見散在癌細(xì)胞簇，另1例在病灶邊緣及基底部仍見片狀癌灶，難以分期)。

1.3檢測方法

1.3.1臨床檢查在新輔助化療前后分別進(jìn)行胃鏡(或超聲胃鏡)、64排增強CT檢查進(jìn)行對比療效評價，手術(shù)患者術(shù)后行病理組織學(xué)檢查、療效評價。

1.3.2基因靶標(biāo)檢測將活檢常規(guī)石蠟包埋腫瘤標(biāo)本送廣州益善生物技術(shù)有限公司醫(yī)學(xué)檢驗中心對標(biāo)本進(jìn)行TUBB3、TYMS mRNA表達(dá)水平檢測。采用分支DNA-液相芯片技術(shù)同時定量檢測組織中TUBB3、TYMS mRNA表達(dá)水平。與傳統(tǒng)方法不同，該方法不需要進(jìn)行RNA的提取及PCR的擴(kuò)增，而是通過捕獲目標(biāo)RNA、信號放大、Luminex檢測獲得檢測結(jié)果，提高了準(zhǔn)確性及可重復(fù)性。

具體步驟：取患者病理石蠟包埋組織樣本進(jìn)行裂解樣本，使其釋放樣本中的RNA，試劑盒中的微粒球進(jìn)一步捕獲目標(biāo)RNA，進(jìn)而放大RNA信號，采用Luminex檢測目標(biāo)mRNA的表達(dá)結(jié)果。對Luminex 2001M多功能流式熒光點陣儀檢測所得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行校正和均一化處理，得到的netMFI值即為TUBB3，TYMS mRNA的相對表達(dá)量。

mRNA表達(dá)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：通過分支DNA液相芯片技術(shù)對進(jìn)展期AEGJ組織中TUBB3、TYMS mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果以高、中、低表示，相對表達(dá)量≥75%為高表達(dá)，25%～<75%為中表達(dá)(60%～<75%為中偏高，40%～<60%為中表達(dá)，25%～<40%為中偏低表達(dá))，<25%為低表達(dá)(其中<10%為超低表達(dá))。將mRNA相對表達(dá)量<25%作為低表達(dá)，而≥25%合并為中高表達(dá)。將中高表達(dá)的患者作為耐藥危險因素。各mRNA表達(dá)水平的高低反映化療耐藥的高低，是判斷預(yù)后的重要指標(biāo)。表達(dá)水平越低，化療的藥物敏感性則越高。數(shù)據(jù)庫為數(shù)千例的中國胃癌人群數(shù)據(jù)庫(數(shù)據(jù)庫由廣州益善醫(yī)學(xué)檢驗所建立)。檢測結(jié)果分析以廣州益善個體化醫(yī)療系統(tǒng)化療方案的形式發(fā)出。

1.4療效判斷以新輔助化療前后胃鏡(或超聲胃鏡)、64排增強CT及術(shù)后病理切片作為療效判斷的證據(jù)。新輔助化療后原發(fā)病灶的療效判定根據(jù)RECIST 1.0[4]標(biāo)準(zhǔn)評估，分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病穩(wěn)定(SD)、疾病進(jìn)展(PD)，以CR+PR計算有效率。毒副反應(yīng)采用NCI-CTC 3.0毒副反應(yīng)分度標(biāo)準(zhǔn)判定[5]。

2　結(jié)果

2.1臨床療效近期療效評價結(jié)果顯示，CR 1例，PR 25例，SD 23例，PD 5例，新輔助化療后均行R0切除。患者的性別、年齡、臨床分期與化療療效無關(guān)(P>0.05)。見表1。

表1　54例患者的近期療效與臨床病理特征的關(guān)系　n

2.2治療情況入組54例患者全部完成2周期XP方案新輔助化療。毒副反應(yīng)主要為惡心、嘔吐、粒細(xì)胞減少、血小板減少、外周神經(jīng)毒性，經(jīng)對癥治療后緩解，未出現(xiàn)Ⅲ度及以上毒副反應(yīng)。新輔助化療后4周行標(biāo)準(zhǔn)根治術(shù)(D2)。術(shù)后并發(fā)癥：2例患者出現(xiàn)吻合口出血，2例患者出現(xiàn)吻合口瘺，均經(jīng)保守治療后痊愈。

Logistic多因素回歸分析結(jié)果顯示TUBB3、TYMS mRNA低表達(dá)是影響新輔助化療療效的獨立因子(P=0.031、0.012)。見表2。

Spearman相關(guān)分析顯示：TYMS mRNA低表達(dá)與腫瘤的分化程度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.335，P=0.015)，而其他各因素之間均無明顯相關(guān)性。

表2近期療效影響因素Logistic多因素回歸分析結(jié)果

影響因素有效無效SEWaldPOROR95%CILowerUpper腫瘤大小/cm <412120.6290.1570.7641.2380.3424.897 ≥41416分化程度 良好11100.7133.2460.0780.2540.0531.118 不良1518TUBB3 低表達(dá)730.8164.4850.0310.1500.0230.861 中高表達(dá)1925TYMS 低表達(dá)1220.91410.1850.0120.0380.0050.238 中高表達(dá)1426

3　討論

研究[8]表明AEGJ與中遠(yuǎn)段胃癌在發(fā)生發(fā)展過程中可能存在不同的分子機(jī)制。腫瘤細(xì)胞耐藥是AEGJ新輔助化療不獲益的原因，也是降低綜合治療患者生存率的主要原因。有研究[9]報道發(fā)現(xiàn)新輔助化療能顯著改善局部進(jìn)展期AEGJ的治療效果。如何預(yù)測AEGJ新輔助化療敏感性的問題有待解決。如果能找到較為準(zhǔn)確的預(yù)測新輔助化療敏感性標(biāo)志物將有助于臨床醫(yī)生根據(jù)腫瘤的分子生物學(xué)特征選擇更有效的治療方案，避免不獲益的化療。

TUBB3與抗微管化療藥敏感性的關(guān)系最密切。在多種腫瘤細(xì)胞系的研究和臨床研究中，都顯示TUBB3低表達(dá)腫瘤患者接受紫杉醇類化療的效果較好，中位生存期較長。反之，TUBB3高表達(dá)患者的抗微管類化療藥物療效較差[10-12]。TYMS是嘧啶核苷酸合成的限速酶，也是氟類藥物發(fā)揮化療作用的主要靶點。TYMS mRNA表達(dá)水平越高，患者接受氟類藥物化療耐藥性越高，反之化療效果越好，生存期越長[13]。

液相芯片是一種全新概念的生物芯片，具有簡單快速、敏感性好、特異性高、節(jié)省樣本量、縮短分析時間、節(jié)約勞動力、檢測費用低，以及多通路、高通量和實時數(shù)據(jù)分析等優(yōu)點[14]。本研究使用廣州益善公司提供的液相芯片分析平臺檢測54例進(jìn)展期AEGJ組織中TUBB3、TYMS mRNA表達(dá)水平。

本研究中應(yīng)用XP方案對進(jìn)展期AEGJ進(jìn)行新輔助化療，有效率為48.15%，與既往的報道基本相似[15]，達(dá)到了降期、提高R0切除率的目的。本組52例患者新輔助化療毒副反應(yīng)主要為惡心、嘔吐、粒細(xì)胞減少、血小板減少、外周神經(jīng)毒性，經(jīng)相應(yīng)治療后緩解，毒副反應(yīng)均在可控制范圍內(nèi)；術(shù)后并發(fā)癥僅有2例吻合口出血、2例吻合口瘺，提示新輔助化療是安全的，并未增加手術(shù)并發(fā)癥及手術(shù)風(fēng)險。單純的印戒細(xì)胞癌或粘液腺癌新輔助化療病情均無緩解[16]。但化療效果與年齡、分化程度無關(guān)。

既往的研究[17]表明，TUBB3高表達(dá)常常預(yù)示著化療無反應(yīng)。本研究結(jié)果也表明，TUBB3 mRNA高表達(dá)也預(yù)示著化療療效不明顯，除了同時TYMS mRNA 低表達(dá)或中偏低表達(dá)。TYMS基因的檢測對于預(yù)測胃癌新輔助化療的療效作用目前尚無統(tǒng)一觀點[18]。本研究結(jié)果表明，TYMS mRNA的表達(dá)與化療敏感性有關(guān)，低表達(dá)患者對新輔助化療敏感，這與部分研究結(jié)果相一致[19]。

Logistic多因素回歸分析顯示，TUBB3和TYMS mRNA低表達(dá)是獨立的化療敏感性影響因素，預(yù)示著較高疾病緩解率。這與胃癌中的研究結(jié)果一致[20]。Spearman相關(guān)分析顯示：TYMS mRNA低表達(dá)與腫瘤的分化程度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.335，P=0.015)。

總之，本研究應(yīng)用分支DNA-液相芯片技術(shù)檢測了2種基因mRNA在進(jìn)展期AEGJ新輔助化療前的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)TUBB3和TYMS mRNA的表達(dá)情況與新輔助化療XP方案的敏感性有關(guān)，其表達(dá)可作為預(yù)測XP方案化療療效的因子。然而，由于本研究樣本量有限，且為回顧性研究，TUBB3和TYMS在進(jìn)展期AEGJ新輔助化療中的預(yù)測價值仍然需要大規(guī)模的前瞻性對照臨床試驗進(jìn)一步證明。

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Expressions of TUBB3,TYMS mRNA in the Locally Advanced Adenocarcinoma of Esophagogastric Junction and the Relationship with Efficacy of Neoadjuvant Chemotherapy

Li Shoumiao1,Han Peng2,Zhang Wei1,Liu Zhiqiang1，Wan Yunjie1,Li Baozhong1,Zhang Zhizhong1

(1.DepartmentofSurgery,AnyangTumorHospital,Anyang455000,China;2.DepartmentofPathology,AnyangTumorHospital,Anyang455000,China)

河南省科技發(fā)展計劃重點攻關(guān)項目(編號：112102310121)

李守淼(1973-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事胃腸道腫瘤外科臨床工作。E-mail:shoumiaoli@126.com

張志忠(1982-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事腹部腫瘤外科臨床工作。E-mail:zhangzz003@163.com

10.3969/j.issn.1673-5412.2016.04.007

R735.2；R730.53

A

1673-5412(2016)04-0304-05

2016-02-12)