大骨節(jié)病軟骨中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激性蛋白分子表達變化研究*

陜西省人民醫(yī)院骨科病院(西安710068)

易　智　武世勛　凌　鳴　劉時璋　劉宗智　孫正明　靳占奎

?

大骨節(jié)病軟骨中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激性蛋白分子表達變化研究*

陜西省人民醫(yī)院骨科病院(西安710068)

易智武世勛凌鳴劉時璋劉宗智孫正明靳占奎

目的：探討活化轉錄因子6 (ATF6)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關促凋亡蛋白C/EBP 同源蛋白(CHOP)在大骨節(jié)病軟骨組織中的表達變化及其與軟骨損傷的關系。方法：收集7例大骨節(jié)病患者術后關節(jié)軟骨標本(KBD組)，7例骨關節(jié)炎病人關節(jié)軟骨(OA組)作為疾病對照，6例正常軟骨組織作為正常對照。采用SP免疫組化染色法檢測三組關節(jié)軟骨組織中AFT6和CHOP表達趨勢，分析其關節(jié)軟骨內(nèi)陽性表達率差異。 結果： KBD組和OA組中層ATF6陽性細胞表達率顯著高于正常軟骨組，而三組表層和深層軟骨ATF6陽性細胞表達率無統(tǒng)計學差異。OA組軟骨表層CHOP表達顯著高于KBD軟骨組和正常軟骨組，而KBD組和正常組間比較無統(tǒng)計學差異；KBD組軟骨和OA組中層CHOP陽性細胞表達率顯著高于正常軟骨組；OA組軟骨深層陽性率高于KBD組。KBD組與OA組ATF6主要表達于中層，正常軟骨組主要表達于中層和深層，KBD組與OA組CHOP主要表達于中層，正常軟骨組CHOP在三層表達無統(tǒng)計學差異。結論：KBD軟骨中層的ATF6和CHOP顯著上調(diào)，表明CHOP高表達可能與大骨節(jié)病軟骨損傷密切相關，而ATF6高表達與其軟骨損傷后反應性細胞增殖有關。

主題詞骨關節(jié)病，原發(fā)肥大性/病理生理學軟骨，關節(jié)/病理生理學蛋白/代謝@活化轉錄因子6

大骨節(jié)病(Kashin-Beck disease, KBD)是一種特殊的地方性、以關節(jié)軟骨壞死為特征性疾病。前期研究結果表明:大骨節(jié)病和骨關節(jié)病(Osteoarthritis，OA)的軟骨損傷均與細胞過度凋亡有關[1]，人骨關節(jié)炎軟骨和動物模型軟骨中發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激標志分子免疫球蛋白重鏈結合蛋白呈現(xiàn)異常高表達[2]。已經(jīng)證實了ATF6(Activating transcription factor-6)過表達與軟骨細胞凋亡及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關促凋亡蛋白C/EBP同源蛋白[3-4](CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP)介導的凋亡與關節(jié)軟骨退變有關。還有研究結果認為OA軟骨內(nèi)ATF6可上調(diào)XBP1S[5]，進而抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激性細胞凋亡。然而，目前尚未見到大骨節(jié)病軟骨組織AFT6和CHOP的表達變化的相關報道。本文以前人研究成果為基礎，探討了大骨節(jié)病軟骨組織損傷過程中內(nèi)ATF6和CHOP表達變化。

材料與方法

1材料按照我國2010年《大骨節(jié)病診斷標準》納入病例，實驗組包括來自陜西人民醫(yī)院骨科KBD病人的膝關節(jié)置換術后軟骨標本7例(KBD組)，疾病對照組為性別、年齡與試驗組相匹配的原發(fā)性骨關節(jié)炎患者膝關節(jié)置換術后軟骨標本7例(OA組)，收集6例健康者截肢術后正常軟骨作為正常對照組(NC組)。所有標本收集均征得患者及家屬知情同意，本研究通過陜西省人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

試劑有兔抗人ATF6抗體(北京博奧森,bs1634R)，兔抗人CHOP抗體(北京博奧森, bs8875R)，SP山羊抗兔二抗即用型試劑盒(北京中杉金橋，SP9012)。

2方法所有軟骨標本收集后，即刻置入4%中性多聚甲醛溶液進行固定，制備病理切片，然后采用常規(guī)SP免疫組織化學染色法進行標記陽性細胞[7]，將關節(jié)軟骨分為表、中、深層，然后分別統(tǒng)計每張染色切片中400倍鏡下一個視野內(nèi)不同軟骨細胞層的陽性細胞表達率。

結　果

1 KBD與OA和正常組關節(jié)軟骨細胞ATF6表達比較結果顯示：ATF6在三組軟骨細胞的細胞核及胞漿中均表達(圖1)。正常組軟骨表層ATF6表達陽性率低于OA組和KBD組，但統(tǒng)計學分析結果無差異(P=0.334)；三組中層之間ATF6表達陽性率有差異(F=15.108，P=0.001)，KBD組和OA組陽性表達率均明顯高于正常組(14.92%±2.27%)；三組軟骨組織深層ATF6陽性率比較無統(tǒng)計差異(F=1.911，P=0.155)。

圖1　三組軟骨細胞中層ATF6陽性表達率比較(A:正常，B:OA，C:KBD)

將三組軟骨組織表層、中層和深層陽性細胞表達率進行統(tǒng)計分析，結果顯示：在正常組，三層細胞表達率有統(tǒng)計意義(F=4.059，P=0.021)，中層和深層陽性表達率均高于表層；在OA組，三層之間的表達率有統(tǒng)計學差異(F=29.408，P=0.001)，中層明顯高于表層和深層，而表層和深層的差異不明顯(P=0.575)；在KBD組，三層之間的表達率有統(tǒng)計學差異(F=50.162，P=0.001)，中層明顯高于表層和深層，而表層和深層的差異也不明顯(P=0.400)，說明KBD軟骨細胞內(nèi)均有ATF6表達，中層表達率最高,見表1。

表1　三組軟骨不同細胞層ATF6表達差異的比較±s，%)

2 KBD與OA和正常組關節(jié)軟骨細胞CHOP表達比較在光學顯微鏡下觀察免疫組化結果顯示：CHOP主要表達于三組軟骨細胞的細胞核及胞漿中(圖2)。計算三組軟骨不同分層CHOP表達陽性率：在表層，三組軟骨組織表達率有明顯差異(P=0.001)，OA組表達率明顯高于正常組和KBD組，但正常組和KBD組的統(tǒng)計學分析結果無差異(P=0.334)；在中層，三組之間的表達率有顯著差異(F=11.192，P=0.001)，KBD組和OA組陽性表達率均明顯高于正常組(P值分別為0.001和0.001)，而OA組和KBD組之間無統(tǒng)計學差異(P=0.700)；在深層，三組軟骨組織的CHOP陽性率存在差異(F=3.193，P=0.048)，表現(xiàn)在OA組高于KBD組(P=0.014)。

將三組軟骨組織表層、中層和深層陽性細胞表達率進行統(tǒng)計分析，結果顯示：在正常組，三層細胞表達率差異有統(tǒng)計意義(P=0.021)，中層陽性表達率均高于表層(P=0.021)，表層和深層無統(tǒng)計學差異；在OA組，三層之間的表達率有統(tǒng)計學差異(P=0.001)，中層明顯高于表層和深層，而表層和深層的差異不明顯(P=0.376)；在KBD組，三層之間的表達率有統(tǒng)計學差異(P=0.001)，中層明顯高于表層和深層，而表層和深層的差異也不明顯(P=0.198)，說明KBD軟骨組織內(nèi)CHOP主要表達于中層，見表2。

表2　三組軟骨不同細胞層CHOP表達差異的比較±s，%)

討　論

既往研究結果表明：KBD患者關節(jié)內(nèi)發(fā)生了顯著的軟骨細胞死亡，且早期主要與軟骨細胞過度凋亡有關，凋亡包括線粒體途徑、死亡受體途徑、JNK/P38途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激四種途徑，發(fā)表的研究結果表明線粒體途徑、死亡受體途徑、JNK/P38途徑[7,8]均可能與KBD的病理變化有關，目前尚不明確內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激途徑是否與KBD有關。

目前認為，ATF6主要與軟骨細胞的增生分化有關，還可以抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導的細胞凋亡[3,5]。在我們的研究中，ATF6表達上調(diào)提示，KBD軟骨組織中軟骨細胞過度凋亡后，ATF6代償性表達增加，試圖減少軟骨細胞過度丟失，可能是一種對傷害性刺激的保護性反應。還需要我們進一步通過細胞分子生物學實驗加以驗證。

Gadd153/CHOP復合物可以通過降低Bcl-2含量和促進谷胱甘肽，促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣離子代謝異常，從而誘發(fā)細胞凋亡[9]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)長期處于這種應激狀態(tài)，最終可以促發(fā)凋亡性細胞死亡[10]。有研究報道:CHOP還可以同過增強死亡受體5表達誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激性細胞凋亡[11]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可通過線粒體途徑誘導細胞凋亡[12]。軟骨組織退變與細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激性過度凋亡及細胞內(nèi)保護性反應抑制[13]有關。軟骨細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激性凋亡機制與晚期糖化終產(chǎn)物聚集有關[14]。寡霉素A可通過CHOP介導的DR5過表達進而增強TRAIL誘導的細胞凋亡[15]。本研究中發(fā)現(xiàn)KBD軟骨組織細胞中CHOP表達異常增高，結合已發(fā)表的研究結果，我們認為KBD軟骨組織細胞中CHOP高表達與其軟骨組織中細胞過度凋亡有關。

進一步明確內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激是否導致KBD軟骨細胞容易損傷或阻止了損傷后修復，及其內(nèi)在分子學機制，是我們今后的主要研究方向之一。

[1]Wang SJ, Guo X, Zuo H,etal. Chondrocyte apoptosis and expression of Bcl-2, Bax, Fas, and iNOS in articular cartilage in patients with Kashin-Beck disease[J]. J Rheumatol， 2006, 33(3): 615-619.

[2]謝靖, 楊冠.骨關節(jié)炎軟骨細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激[J].生物技術通訊, 2013，(6):787-791.

[3]Han XF, Zhang P, Jiang R,etal. Explore on the effect of ATF6 on cell growth and apoptosis in cartilage development[J]. Histochem Cell Biol， 2014, 142:497-509.

[4]Uehara Y, Hirose J, Yamabe S,etal. Endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis contributes to articular cartilage degeneration via C/EBP homologous protein[J]. OsteoarthritisCartilage, 2014, 22(7):1007-1017.

[5]Guo FJ,Xiong ZY,Lu XJ,etal. ATF6 upregulates XBP1S and inhibits ER stress-mediated apoptosis in osteoarthritis cartilage[J]. Cellular Signalling, 2014, 26 :332-342.

[6]武世勛，郭雄，張峰，等.大骨節(jié)病與骨關節(jié)病軟骨組織死亡相關因子表達的比較[J].J South Med Univ, 2014, 34(12): 1785-1789.

[7]Liu JT, Guo X, Ma WJ,etal. Mitochondrial function is altered in articular chondrocytes of an endemic osteoarthritis, KashineBeck disease[J]. Osteoarthritis Cartilage, 2010, 18:1218-1226.

[8]Han J, Guo X, Tan WH,etal. The expression of p-ATF2 involved in the chondeocytes apoptosis of an endemic osteoarthritis, Kashin-Beck disease[J]. BMC Musculoskeletal Disorders, 2013, 14:209.

[9]Iqbal J, Meyer PN, Smith L,etal. BCL2 predicts survival in germinal center B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma treated with CHOP-like therapy and rituximab[J]. Clin Cancer Res, 2011,17(24):7785-7795.

[10]Jwa M, Chang P. PARP16 is a tail-anchored endoplasmic reticulum protein required for the PERK- and IRE1alpha-mediated unfolded protein response[J]. Nat Cell Biol, 2012,14(11):1223-1230.

[11]Yamaguchi H, Wang HG. CHOP is involved in endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis by enhancing DR5 expression in human carcinoma cells[J]. J Biol Chem, 2004,279(44):45495-45502.

[12]Shiraishi H, Okamoto H, Yoshimura A,etal. ER stress-induced apoptosis and caspase-12 activation occurs downstream of mitochondrial apoptosis involving Apaf-1[J]. J Cell Sci, 2006,119(19):3958-3966.

[13]Koji T，Jun H，Kei S,etal. Enhanced apoptotic and reduced protective response in chondrocytes following endoplasmic reticulum stress in osteoarthritic cartilage[J]. Int J Exp Pathol, 2011, 22(5):434-442.

[14]Yamabe S，Hirose J，Uehara Y,etal. Intracellular accumulation of advanced glycation end products induces apoptosis via endoplasmic reticulum stress in chondrocytes[J]. Febs Journal, 2013, 280(7):1617-1629.

[15]Long H, Jang JH, Choi HG,etal. Oligomycin A enhances apoptotic effect of TRAIL through CHOP-mediated death receptor 5 expression[J]. Molecular Carcinogenesis, 2013, 52(2):85-93.

(收稿：2016-04-20)

Changed expression of protein molecule related to ER stress in KBD cartilage

Department of Orthopaedics of the Shaan’xi Province People’s Hospital

(Xi’an 710068)Yi ZhiWu ShixunLing Minget al

Objective: To investigate the expression of ATF6 and CHOP in KBD cartilage changes and its relationship with KBD cartilage injury.Methods: 7 specimens of articular cartilage were collected from KBD patients under operation (KBD group), 7 cases from patients suffered from osteoarthritis (OA group) as disease control, 6 normal cartilage as normal controls. Expression of AFT6 and CHOP as key regulators in ER stress of three groups articular cartilage was detected using immunohistochemical staining,significant differences expression among the articular cartilage was analyzed. Results:In middle layer, ATF6-positive expression rate in KBD group and OA group was significantly higher than this of normal cartilage group, while in the surface and deep, ATF6 positive cells among three groups was no statistical difference。In surface layer,CHOP-positive expression rate in OA cartilage was significantly higher than this of KBD and normal, while no statistical difference was found between KBD and the normal group; while in middle layer, CHOP-positive expression rate in KBD cartilage group and OA groupwas significantly higher than normal group, positive rate of deep in OA cartilage was higher than KBD group。 ATF6 of KBD and OA group was mainly expressed in the middle layer, whilemiddle and deep in normal cartilage, CHOP of KBD and OA group was mainly expressed in the middle layer.Conclusion: Both ATF6 and CHOP in middle layer of KBD cartilage was increased significantly, indicating that CHOP may be closely related to the KBD cartilage damage; while ATF6 was related with react Aive cell proliferation after cartilage injury.

Osteoarthropathy,primary hypertrophic/physiopathologyCartilage,articular/physiopathlogyEggwhite/metabolism@AFT6

R684.1

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.09.004

*陜西省社會發(fā)展科技攻關項目(2015SF138)