四逆散對慢性胰腺炎模型小鼠MDA和SOD表達水平的影響*

史迎莉　許小凡　劉　芳　張曉芹　張　紅

陜西中醫藥大學醫學科研實驗中心(咸陽712046)

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四逆散對慢性胰腺炎模型小鼠MDA和SOD表達水平的影響*

史迎莉許小凡劉芳張曉芹張紅△

陜西中醫藥大學醫學科研實驗中心(咸陽712046)

目的：觀察四逆散對慢性胰腺炎小鼠胰腺組織中MDA和SOD的影響。方法：48只昆明小鼠，隨機分為3組。模型組與四逆散組經尾靜脈一次性注射二氯二丁基酯(DBTC) 0.8mg/100g體重，并用10%的乙醇代替飲用水，誘發小鼠慢性胰腺炎。造模后72h，治療組給予四逆散6g/(kg·d)灌胃，空白組和模型組給予等量生理鹽水灌胃。分別于造模后2周、8周，處死小鼠，取胰腺組織，檢測MDA和SOD的變化，HE染色觀察胰腺病理學改變。結果：造模后，模型組胰腺MDA的水平持續升高，而SOD活性持續降低，二者于相應時間點的對照組相比差異顯著。HE染色結果顯示，造模后2周，模型組小鼠胰腺可見炎細胞浸潤，胰腺小葉間纖維化;造模后8周，可見腺泡細胞和胰島明顯減少，大量炎細胞浸潤，胰腺實質壞死，被纖維組織替代；四逆散治療后，與模型組相比，相應時間點胰腺組織MDA的水平下降，而SOD的水平有所升高;相應時間點胰腺組織的損傷有所減輕。結論：四逆散通過調節胰腺組織MDA和SOD的活性水平來防治DBTC聯合乙醇所致慢性胰腺炎小鼠的胰腺炎纖維化。

主題詞胰腺炎四逆散

慢性胰腺炎(Chronic pancreatitis，CP)是由多種原因引起的胰腺實質出現不可逆的慢性炎癥，胰腺間質纖維化，胰腺腺泡和胰島萎縮或消失，引起胰腺內、外分泌功能不全，臨床表現為反復發作的上腹痛[1]。近年來，CP在我國發病率不斷增高，臨床上無特異性的療法，僅限于對癥治療或緩解癥狀，治療效果不佳，臨床難以治愈[2]。本實驗采用小鼠尾靜脈注射二氯二丁基酯(Dibutyltin Dichloride，DBTC)，同時飲用10%乙醇誘發小鼠CP模型，給予四逆散灌胃，觀察其對CP小鼠胰腺丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)水平的影響，探討四逆散防治CP的作用機制。

1材料1.1試劑與儀器四逆散(柴胡6g，枳殼、白芍、黃芩、木香各5g，炙甘草3g)中藥飲片購自陜西中醫藥大學一附院中藥房，常規水煎濃縮至29ml(1g生藥/ml)，分裝后置于4℃冰箱保存備用。二氯二丁基酯(DBTC)購自Sigma-Aldrich；小鼠SOD和MDA檢測試劑盒購于南京建成生物所；組織勻漿機(德國IKA)；酶標儀(Bio-Tek，ELX808)；高速冷凍離心機(德國eppendorf,5430R)，顯微鏡及圖像采集系統(德國蔡司Axio Imager，A2)。

1.2動 物昆明小鼠48只，雄性，6～8周齡，體重20～28g；購于第四軍醫大學實驗動物中心(動物合格證號：0001249)。

2方法2.1分組及造模將48只小鼠隨機分為3組(n=16)，即對照組(尾靜脈注射0.9% NaCl+正常飲水)；模型組(尾靜脈注射DBTC+飲用10%乙醇)；四逆散組(尾靜脈注射DBTC +飲用10%乙醇+四逆散灌胃)。模型復制：48只昆明小鼠，保持室溫20℃～25℃，自由飲水、攝食，適應性喂養1周，適應環境后用于實驗。將80mg DBTC溶于30ml無水乙醇，緩緩加入10ml甘油，再滴加生理鹽水至50ml，搖至清亮(1.6g/l),經尾靜脈一次性注射DBTC(0.8mg/100g)后，用10%乙醇代替飲用水，常規飼料飼喂，復制小鼠CP模型。造模后第3天，隨機分為模型組和四逆散組，模型組飲用10%乙醇，標準飼料飼喂；四逆散組給予四逆散濃縮液生藥含量6g/(kg·d),0.2～0.4ml/只/d灌胃，1劑/d，分別灌胃2周、8周，同時飲用10%乙醇。對照組按照50μl/10g體重經尾靜脈注射生理鹽水，之后常規攝食、飲水。對照組和模型組在相同的時間點給予等量生理鹽水灌胃。

2.2標本采集與檢測分別于造模后2周、8周乙醚吸入麻醉，處死實驗動物，完整摘取胰腺，一部分胰腺用10%甲醛浸泡固定，行HE染色并觀察病理學改變；另一部分新鮮胰腺，液氮速凍后，-80℃冰箱保存，制備組織勻漿，進行SOD和MDA活性檢測。

2.3胰腺組織的病理學改變甲醛固定后的胰腺組織，常規石蠟包埋、切片，進行蘇木素-伊紅染色，鏡下觀察各組胰腺的形態學改變，并拍照采集圖像。

2.4胰腺MDA和SOD的檢測取50mg新鮮胰腺組織置于EP管中，加入緩沖液，用組織勻漿器勻漿，高速冷凍離心機4℃，10000r/min，離心10min，吸取上清，按試劑盒要求檢測胰腺組織MDA和SOD表達水平。

2.5統計學方法用均數±標準差表示實驗數據，用SPSS13.0統計軟件處理分析，各組間的比較采用單因素方差分析，P<0.05表示具有統計學意義。

3結果3.1胰腺組織的病理學變化如圖1所示，造模后2周，模型組小鼠胰腺可見少量胰腺腺泡細胞萎縮、壞死，炎細胞浸潤，小葉間可見少量纖維化；造模后8周,可見胰腺腺泡細胞及胰島萎縮、消失，大量纖維組織增生。但是四逆散治療組，在相同時間點胰腺的炎癥損傷程度及纖維化程度明顯減輕。

A:對照組2周；B:對照組8周；C:模型組2周；D：模型組8周；E：四逆散組2周；F：四逆散組8周

3.2胰腺組織MDA和SOD活性變化小鼠尾靜脈注射DBTC造模后，胰腺組織MDA水平隨著造模時間的延長，持續升高；而SOD水平則隨著造模時間延長持續降低，與對照組相比，差異具有顯著性(P<0.01)；四逆散組MDA水平與相同時間點模型組相比明顯降低，而SOD水平與相同時間點模型組相比明顯升高，差異具有顯著性 (P<0.01)。

4討論CP病因復雜，如長期飲酒或膽道疾病等可引起胰腺實質慢性炎癥，最終被纖維結蹄組織代替[1]。SOD是生物體內廣泛存在的一種金屬酶，能將超氧陰離子催化為過氧化氫和氧氣，清除體內氧化自由基，使體內自由基的產生與清除保持動態平衡，起到重要的抗氧化作用[3]。MDA是氧自由基作用于機體脂質發生過氧化的產物，其含量高低可間接反映機體內氧自由基的含量及機體受損傷程度[4]。SOD能夠清除過量的氧自由基、消除炎癥，具有極強的抗炎作用[5]。慢性胰腺炎就是一種不可逆的炎癥性疾病，體內堆積過多的氧自由基，如不能及時被清除，將與細胞膜發生反應，生成過多的MDA引起炎癥反應和組織損傷[6]。SOD能夠抑制炎癥的進展、具有抗氧化的作用，從而減輕胰腺纖維化程度，因此檢測SOD含量對慢性胰腺炎的診斷和治療有客觀價值。

近期實驗研究發現，在注射 DBTC 基礎上聯合飲用10% 乙醇的造模方法復制小鼠CP模型，這種方法成功率高、成本較低，造成的小鼠CP模型較符合人慢性胰腺炎的病理特征和血清學改變，適合做藥物治療研究[7]。本實驗發現，CP發展過程中機體的抗氧化能力不斷降低。四逆散灌胃治療后，可通過抗氧化作用，減輕CP小鼠的胰腺損傷程度。

CP屬于中醫的“腹痛”范疇，多為脾虛、肝郁氣滯，血瘀所致。四逆散出自《傷寒論》，是疏肝透解，活血化瘀，緩急止痛的要方。本實驗在原方：柴胡、白芍、枳殼、甘草的基礎上加入黃芩、木香。近期藥理研究顯示,柴胡皂甙具有很強的抗炎作用及抗纖維化作用；黃芩苷具有抗氧化及清除氧自由基的能力；芍藥苷具有抗自由基損傷的作用，能減少SAP大鼠胰腺促炎因子的釋放，對大鼠SAP具有治療作用[8]。枳殼、甘草酸亦具有抗炎、抗氧化作用,木香具有行氣利膽，鎮痛的作用。我們的實驗結果亦發現，四逆散治療組小鼠，胰腺組織的MDA在2周，明顯下降，并一直維持在較低水平，而SOD的水平在治療后逐漸升高。提示四逆散能夠通過提升CP小鼠胰腺的抗氧化能力，減輕CP小鼠的胰腺損傷程度及胰腺纖維化的程度，為四逆散用于臨床防治CP提供了實驗根據。

[1]中華醫學會外科學分會胰腺外科學組. 慢性胰腺炎診治指南(2014)[J]. 中國實用外科雜志，2015，35(3)：277-282.

[2]張天玲,蘇式兵.中藥防治慢性胰腺炎的基礎實驗研究進展[J].中華中醫藥學刊，2011，29(6)：1225-1228.

[3]張笑天,鄭曉瑛.氧化自由基清除劑超氧化物歧化酶與疾病[J].中國公共衛生,2014,30(10):1349-1352.

[4]王少言,初巍巍,霍陽,等. 黃芪注射液對重癥急性胰腺炎大鼠外周血清氧化相關物質的影響[J].解放軍醫藥雜志,2014,26(12):5-7.

[5]朱秀敏.超氧化物歧化酶的生理活性[J].當代醫學,2011,17(15)：26-27.

[6]趙鐵華,唐曉勇,盛麗,等.膽胰寧對慢性胰腺炎大鼠血清及胰腺組織中超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量的影響[J].中國實驗方劑學雜志,2011,17(20)：230-233.

[7]張曉芹,許小凡,姜婷婷,等.柴胡疏肝散通過抗氧化反應對二氯二丁基酯聯合乙醇誘發小鼠胰腺纖維化的防治作用[J]．中國病理生理雜志，2014，30(10):1827-1832．

[8]李仁國.柴胡有效成分及藥理作用分析[J].陜西中醫,2013,34(6)：750-751.

(收稿2016-03-30；修回2016-05-15)

*陜西省咸陽市科技局自然科學基金[2011K13-06(1)]

R657.5

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2016.09.072