腹腔氫氣和飽和氫鹽水對家兔心肌缺血再灌注損傷及超微結構的影響

牟春平，劉云寶，鄒永偉，王文凱，楊文文

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腹腔氫氣和飽和氫鹽水對家兔心肌缺血再灌注損傷及超微結構的影響

牟春平1，劉云寶2，鄒永偉1，王文凱1，楊文文1

目的 探討腹腔氫氣和靜脈飽和氫鹽水對家兔心肌缺血/再灌注損傷及心肌超微結構的影響。方法將40 只家兔麻醉開胸隨機分為假手術組(A組)、模型對照組(B組)、腹腔氫氣組(C組)和飽和氫鹽水組(B組)各10只。假手術組冠脈穿線不結扎，余3組冠脈結扎60 min后再灌注同時，B組5只腹腔氧氣10 mL/kg一次性注入，5只靜脈生理鹽水10 mL/kg10 min泵入，C組腹腔氫氣10 mL/kg10 min注入；D組靜脈飽和氫鹽水10 mL/kg泵入。B組、C組D組均再灌480 min。結果A組、C組、D組超氧化物歧化酶(SOD)明顯高于B組，但A組、C組、D組間兩兩比較差異無統計學意義(P>0.05)；A組、C組、D組抑制羥自由基能力明顯大于B組。電鏡和Tunnul監測顯示：A組、C組、D組細胞凋亡數明顯少于B組，心肌結構相對完整，線粒體細胞核損傷較小，僅見少量溶酶體無自噬體，而B組心肌組織破壞嚴重細胞膜線粒體脊融合斷裂較重，形成空泡部分溶酶體空泡形成，可見多個自噬體。結論兩種給氫方法均能保護缺血再灌注損傷，這種保護作用與H2清除自由基抗炎、抗凋亡有關。腹腔氫氣較靜脈氫鹽水應用方便效果更佳。

心肌缺血再灌損傷；腹腔氫氣；飽和氫鹽水；自由基；氧反應激；超微結構

1　材料與方法

1．1動物分組新西蘭白兔40只(浙江農業科學院提供，許可證SCXK浙江2010-0047)，體重2.5 kg±0.5 kg，雌雄不限，隨機分為假手術組(A組)、模型對照組(B組)、腹腔氫氣組(C組)和飽和氫鹽水組(B組)各10只。

1.2心肌缺血/再灌注損傷(I/R)模型制備

1.2.1麻醉及動物模型術前禁食不限水12 h，3%戊巴比妥鈉30 mg/kg，耳靜脈注入，并根據麻醉深淺適當補充麻藥，應用HX-10E動物呼吸機(成都泰盟公司)氣管插管維持正常通氣，按文獻[1]報道方法開胸結扎冠脈前降支，成功60 min后松解再灌注480 min的方法復制I/R模型。

1.2.2干預方式A組開胸后冠脈穿線不結扎，其中5只腹腔氫氣10 mL/kg一次注入，5只耳靜脈生理鹽水10 mL/kg 10 min泵入；B組再灌注同時其中5只氫氣10 mL/kg腹腔注入，5只耳靜脈生理鹽水10 mL/kg 10 min泵入；C組10只再灌注同時立即10 mL/kg氫氣腹腔一次注入；D組10只，再灌注同時立即耳靜脈10 min泵入10 mL/kg飽和氫鹽水。

1.3高純氫和飽和氫鹽水制備應用TM型氫氣發生器(濟南駿銘分析儀器有限公司提供)，電解超純水產生純度為99.999%，將500 mL高純氫氣無死腔注入含有300 mL生理鹽水的鋁鉑袋中，放入0.4 kPa高壓艙壓溶6 h制備飽和氫鹽水，H2濃度為0.77 mmol/L～0.80 mmol/L消毒備用。

1.4主要檢測指標和實驗儀器腫瘤壞死因子a(TNF-α)Elisa試劑盒，武漢福爾生物科技股份公司(批號L150519248)；總超氧化物歧化酶(TSOD)試劑盒，南京建成生物工程研究所(批號20150514)；羥自由基(·OH)試劑盒，南京建成生物工程研究所(批號20150517)；丙二醛(MDA)，南京建成生物工程研究所(批號20150530)；細胞凋亡，Tunle檢測；電鏡，TECNAI-10荷蘭菲公司利浦；全波長酶標儀，Specrroplus 3840美國MD公司。以上所有測試組織和血液標本采集后均-80 ℃保存，并嚴格按說明書操作并記錄測定數據。

2　結　果

2.1各組觀察指標比較A組、C組、D組TSOD、MDA與B組相比差異有統計學意義(P<0.05～P<0.001)，但A組、C組、D組差異無統計學意義(P>0.05)。A組、C組、D組TNF-α與B組相比差異有統計學意義(P<0.05～P<0.001)；C組與D組相比差異有統計學意義(P<0.05)，表明在對抗TNF-α的作用方面，腹腔氫氣優于靜脈飽和氫鹽水。對羥自由基抑制作用：C組和D組對抗羥自由基作用最強，與B組相比，A組、C組、D組抑制羥自由基能力差異有統計學意義(P<0.05～P<0.001)，A組、C組相比差異有統計學意義(P<0.05)，而A組與D組相比差異無統計學意義(P<0.05)。A組、C組、D組心肌凋亡與B組相比差異有統計學意義(P<0.05～P<0.001)；C組、D組比較差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表1。

表1　各組觀察指標比較(±s)

2.2電鏡A組心肌細胞膜、線粒體和染色體結構完整，未見溶酶體和自噬體，B組心肌細胞局部溶解、斷裂、線粒體嵴融合斷裂較重，形成空泡，核皺縮，溶酶體部分空泡化，數個自噬體形成；C組心肌細胞排列有序正常，線粒體結構也較正常，細胞凋亡不明顯，也無自噬體形成，僅少量肌絲斷裂和線粒體破壞；D組肌絲和線粒體改變也較B組明顯減輕，也無明顯細胞凋亡和自噬體形成。

3　討　論

研究表明：缺血再灌注損傷可導致血管內皮損傷炎性反應和細胞凋亡，心肌微循環障礙及心功能障礙等嚴重后果，其發生發展與氧化應激產生的活性氧自由基(reactive oxygen species)羥自由基、超氧化氮(ONOO)等活性最強的自由基密切相關。

近幾年來，眾多學者對氫的醫學研究涉及多學科和領域，提出氫的抗炎、抗過敏和抗凋亡作用，有研究報道不同給氫方式或量可產生不同的組織器官保護作用[2-5]，也有報道能產生相似保護作用。總之，氫醫學有益作用研究的結論差異可能有多種原因：作為萬能還原劑，氫可以改變大多數物質結構清除自由基，這種作用可能與劑量和失效相關[6-8]；給氫的途徑、劑量、時機和生物利用度，也是影響氫療效原因[9]。

本研究也從以下幾個方面證明了氫的清除自由基、抗炎和抗凋亡作用：①無論腹腔氫氣和靜脈飽和氫鹽水均能提高心肌超氧化物歧化酶(SOD)水平，這可能與氫直接中和或清除自由基減少SOD消耗相關，也是其抗炎、抗凋亡的主要原因；②H2對·OH自由基抑制作用和抗過氧化物作用也表明腹腔H2作用最強，飽和氫鹽水次之，這是由于氫直接清除自由基減少氧化應激的直接證據；③TNF-α是炎癥指標之一[10]，本研究測定數值也顯示腹腔氫氣和靜脈飽和氫鹽水明顯低于模型對照組，而且腹腔氫氣的值更低；④細胞凋亡和電鏡檢查結果也顯示氫氣具有減少細胞凋亡，保護心肌超微結構的作用，這種抗凋亡和保護心肌作用與氫氣清除自由基、減少SOD消耗劑抗炎密切相關。

本研究證明：①腹腔氫氣和靜脈飽和氫鹽水均能發揮對抗自由基和抗凋亡等保護心肌作用，而且由于腹腔氫氣給予氫氣量相對多于靜脈法，其作用好于靜脈應用；②腹腔氫氣方式方便可靠，與靜脈法相對比，對心血管血流動力學影響較小，而且氫分子為質量最輕很容易穿透細胞膜，擴散到周圍的組織，不完全依賴血管系統，無論靜脈輸入、口服由于腹腔氫氣均能發揮抗自由基、抗炎和抗凋亡作用；③迄今為止，尚不清楚哪種給氫方式更好，因而探討對具體疾病或疾病模型的最佳給氫方式或劑量和作用機制是今后研究的主要方向。

[1]衛洪超，胡盛壽，張浩，等.急性心肌梗死動物模型標準化研究[J].中國心血管病研究，2012，10(7)：528-539.

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[5]Yoshida A，Asanuma H，Sanada S，et al.H2mediates cardioprotection via involvements of K(ATP) channels and permeability transition in marine heart[J].J Physiol Heart Circ Physiol，2013，305(4)：H542-550.

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(本文編輯郭懷印)

1.海南省第二人民醫院(海南三亞 572200)；2.清華大學第一附屬醫院

劉云寶，E-mail：13701186952@sina.com

R542.2R256.2

A

10．3969/j．issn．1672-1349．2016．16．011

1672-1349(2016)16-1862-02

2016-05-13)