多元福利措施改善巴馬小型豬福利狀況的實驗評價

胡　櫻, 楊　斐（復旦大學實驗動物科學部, 上海200030）

多元福利措施改善巴馬小型豬福利狀況的實驗評價

胡櫻, 楊斐
（復旦大學實驗動物科學部, 上海200030）

目的研究多元福利措施（組合應用音樂、香薰、營養(yǎng)、玩具、生物活性墊料等環(huán)境豐富元素）對實驗小型豬整體福利狀況的綜合改善作用。方法將來自6窩的12頭雌性巴馬小型豬（每窩2頭）分別編入常規(guī)飼養(yǎng)組和優(yōu)化飼養(yǎng)組飼養(yǎng)9周，測定兩組的應激分子表達、免疫平衡、血常規(guī)指標和生長情況。結果相比于常規(guī)飼養(yǎng)組，優(yōu)化飼養(yǎng)組具有更低的皮質醇水平和干擾素-γ/白細胞介素-4比值，糖皮質激素受體（GR） mRNA和熱休克蛋白70 （HSP70） mRNA表達更少，紅細胞數(shù)（RBC）、血紅蛋白（HGB）、紅細胞比容（HCT）、平均紅細胞體積（MCV）、平均紅細胞血紅蛋白含量（MCH）、白細胞數(shù)（WBC）、中性粒細胞（NEUT）和嗜酸性粒細胞（EO）較高。結論采用多元福利措施的優(yōu)化飼養(yǎng)有助降低日常飼養(yǎng)中小型豬的應激水平，提高抗應激能力，同時可引起免疫平衡和血常規(guī)指標相應改變。

實驗用小型豬； 應激； 環(huán)境豐富

小型豬因其獨特的生物學特性以及在實驗操作和飼養(yǎng)管理等方面的便利性，近年來在生命科學領域和生物醫(yī)藥行業(yè)備受青睞，其實驗應用日益廣泛，但對實驗用小型豬的日常飼養(yǎng)管理多沿襲畜牧業(yè)中經(jīng)濟動物的模式和觀念，既難以滿足動物實驗研究對實驗用小型豬飼育的特殊要求，也未能從實驗動物的角度考慮小型豬的福利需求。不同于肉用豬福利技術側重于育肥技術以及如何降低運輸和屠宰時的應激，實驗用小型豬福利技術主要關注如何降低其日常飼養(yǎng)應激和實驗操作應激［1］。本研究根據(jù)小型豬感官發(fā)達、情緒豐富的生物學特性，運用動物福利原理探索了整合有玩具、音樂、香薰、營養(yǎng)和生態(tài)墊料的多元福利措施對改善實驗用巴馬小型豬整體福利狀況的作用及其潛在機制，以期為實驗用小型豬的福利評價和干預技術的研究應用提供科學依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗動物

普通級雌性巴馬小型豬12頭, 體質量10±1 kg,江蘇省吳江田宇生物科技有限公司提供（種源來自廣西巴馬原產地）［SCXK（蘇）2011-0001］，飼養(yǎng)于普通級環(huán)境［SYXK（蘇）2015-0035］。

1.2主要儀器和試劑

IDEX ProCyte Dx全自動五分類動物血細胞分析儀及配套試劑包；ABI Vii7 PCR儀；DNM-9602酶標儀；GE LAS4000膜芯片檢測儀；豬皮質醇ELISA kit（LDN）； Porcine Cytokine Array Q1 kit（Biotnt）；trizol （invitrogen）, M-MLV （promega），Recombinant Rnasin （promega）, cDNA第一鏈合成試劑盒（Biotnt），PCR master mix （Biotnt）； 引物采用oligo和primer5設計并由invitrogen公司合成，β-actin上游引物：5'-TCCTCTCTTGCCTCTCTTTG-3'； β-actin下游引物：5'-CACGAGCCAGTGTTAGTACC-3'； 糖皮質激素受體（GR）上游引物：5'-CGAATGTGAAGGGTCAGACT-3'； GR下游引物：5'-CTCCAAATGTCAAAGGTGCT-3'； 熱休克蛋白70（HSP70）上游引物：5'-ATGCCACCATCCCTAC-AAAG-3'； HSP70下游引物：5'-GCCCTCTCACCC-TCATACA-3'。

1.3分組與處理

1.3.1分組12頭小豬分別選自6窩，每窩2只，分別編入優(yōu)化飼養(yǎng)組和常規(guī)飼養(yǎng)組, 每組6頭。編組后給予2周適應期按常規(guī)飼養(yǎng), 無任何處理。2周后, 對優(yōu)化飼養(yǎng)組應用多元福利措施（音樂、香薰、玩具、營養(yǎng)、生態(tài)墊料組合應用）, 常規(guī)飼養(yǎng)組繼續(xù)按常規(guī)飼養(yǎng), 無任何實驗處理。實驗時間9周。

1.3.2常規(guī)飼養(yǎng)組的處理動物飼養(yǎng)于鋪設常規(guī)水泥柵格地面的圈舍內，每天上午8∶00～9∶00、下午14∶00～15∶00分別按0.5 kg/頭給予小型豬配方飼料，采用自動飲水裝置24 h連續(xù)供水，無其他處理。

1.3.3優(yōu)化飼養(yǎng)組的處理在優(yōu)化飼養(yǎng)組圈舍地面鋪設厚度為50 cm的成熟生態(tài)墊料（含75 m3鋸末與100 kg預混益生菌制劑）, 圈內放入直徑20 cm的塑膠皮球1個, 懸掛鐵鏈3根, 每日上午8∶00～9∶00飼喂時，按動物體質量的0.15%將預制營養(yǎng)干預劑粉劑（紅景天提取物∶沙棘提取物∶靈芝提取物∶枸杞子提取物為1∶1∶1∶1）均勻摻入飼料中供自由采食，飼喂結束后，以無序循環(huán)方式播放音樂2 h（55 dB），樂曲選自BANDARI輕音樂（african meditation，allegia，annies wonderland，blue agoon，breath of the wind，childhood memory，ield of tears，moning air，mother nature，the yinstrels tale）； 同時開啟香薰爐2 h, 每次使用0.1 mL精油（組分包括伊蘭、甜橙、廣藿香、花梨木提取物）。其他飼養(yǎng)操作同常規(guī)飼養(yǎng)組。

1.4指標測定

實驗期間每周測量動物體質量，實驗結束后所有動物以電擊致暈后經(jīng)頸靜脈采血10 mL，其中1 mL全血采用EDTA-2K抗凝后儀器法測定血液學指標, 其余9 mL全血于室溫（20～22 ℃）靜置30 min,再于4 ℃環(huán)境中 3 000 r/min離心分離血清, ELISA法測定血清皮質醇（Cortisol）含量, 采血后立即無菌解剖采集每頭豬的心臟、肝臟、腎臟和脾臟組織各一份（約200 mg/份）, 芯片法測定白細胞介素-4（IL-4）、干擾素-γ（IFN-γ）含量，實時熒光PCR法測定心臟、肝臟、腎臟、脾臟組織中GR mRNA和HSP70 mRNA水平。

1.5數(shù)據(jù)處理

2　結果

2.1血清中激素和細胞因子含量

優(yōu)化飼養(yǎng)組皮質醇、IFN-γ以及IFN-γ/IL-4 比值均低于常規(guī)飼養(yǎng)組（P＜0.05）（表1）。

表1　血清應激激素與細胞因子含量（n=6）

2.2GR mRNA表達水平

優(yōu)化飼養(yǎng)組的心臟、腎臟和肝臟中的GR mRNA均低于常規(guī)飼養(yǎng)組（P＜0.05）（圖1）。

2.3HSP70 mRNA表達水平的測定

優(yōu)化飼養(yǎng)組心臟、腎臟和肝臟中的HSP70 mRNA均低于常規(guī)飼養(yǎng)組（P＜0.01）（圖2）。

2.4血常規(guī)指標

與常規(guī)飼養(yǎng)組比較, 優(yōu)化飼養(yǎng)組紅細胞數(shù)、血紅蛋白、紅細胞壓積、平均紅細胞容積及白細胞數(shù)、中性粒細胞數(shù)和嗜酸性粒細胞數(shù)均較高（P＜0.01）,平均紅細胞血紅蛋白量也較高（P＜0.05），紅細胞分布寬度較低（P＜0.05）（表2）。

2.5動物生長曲線測定

優(yōu)化飼養(yǎng)組和常規(guī)飼養(yǎng)組間體質量增長無顯著性差異（圖3）。

圖1　GR基因在小型豬不同臟器中的表達

圖2　HSP70基因在小型豬不同臟器中的表達

表2　小型豬血常規(guī)指標測定

圖3　實驗期間小型豬生長曲線

3　討論

本研究顯示，接受多元福利措施的小型豬不僅血清中的皮質醇水平較按常規(guī)飼養(yǎng)的更低，其心、腎、肝、脾中應激相關基因（GR和HSP70）的表達水平也更低。該結果從機體應激的核心效應分子角度提示該優(yōu)化飼養(yǎng)有利于實驗小型豬在日常生活中維持較低的整體應激水平。根據(jù)動物福利原理，盡管生活在標準化環(huán)境中的常規(guī)飼養(yǎng)動物未接受任何實驗處理，單調貧瘠的圈舍陳設也會形成刺激缺失”應激原，這正是環(huán)境豐富技術的理論基礎［2］。“刺激缺失”主要通過兩種途徑損害動物福利：一是阻止動物表達天性，二是降低動物對環(huán)境變化的適應性。天性行為是動物保持正常生理和心理狀態(tài)所必需的一些行為，諸如磨爪、磨牙、自我修飾、探索、玩耍、相互梳理等天性行為看似和生存無必然聯(lián)系，卻有助于動物釋放情緒和建立良好社會關系，因此一旦環(huán)境中缺乏完成這些天性的條件，動物就會因為情緒的積累或社交障礙而引發(fā)焦慮、孤獨、乏味等應激狀態(tài)，常此以往易導致動物生理和心理異常，生存質量下降。由于目前的實驗動物標準化飼養(yǎng)環(huán)境中通常缺乏足夠的設施、器材供動物表達天性，由此導致“刺激缺失”普遍存在。本研究根據(jù)小型豬好奇、好動、好拱等心理和行為特征及其對環(huán)境多樣化的需求［3］，提供松軟的發(fā)酵鋸末為墊料替代常規(guī)的水泥地面，滿足其翻拱探索的習性［4］，并提供懸垂鐵鏈和塑膠球滿足其拖拽、推頂?shù)耐嫠Ｐ枨螅?］，有效豐富了環(huán)境構成，一定程度上彌補了缺失的刺激，同時，該墊料能為小型豬躺臥時提供舒適環(huán)境，緩和沖突，減少清理圈舍帶來的不適和應激［6］。其二，鑒于適度的環(huán)境改變有利于動物保持合理的警惕，以便隨時微調生存策略和行為模式等，以更小的生物學代價完成適應過程，本研究針對小型豬聽覺和嗅覺敏銳、偏好甜食的特點，采用飼喂后定時播放節(jié)奏舒緩并具有自然鳥鳴、風聲、水聲的輕音樂豐富聽覺環(huán)境，定時采用具有舒緩安撫效果的天然精油香薰豐富其嗅覺環(huán)境，以及在飼料中添加補氣生血且口感微甜的天然藥食同源食材制成的營養(yǎng)干預劑豐富飼料口感，這些元素與圈舍陳設相結合，營造了一個覆蓋多種感官、滿足多重生理需求且具有適度變化的多元化豐富飼養(yǎng)環(huán)境，通過長期反復的微弱新異刺激上調動物應激響應閾值，由此提高其對環(huán)境變化的耐受性和適應性。再者，本研究所選擇的音樂、精油和營養(yǎng)干預劑本身亦可單獨發(fā)揮一定的緩解機體應激、調理臟腑機能、提高機體適應性的作用，通過組合應用，更可有效降低小型豬應激本底。

IFN-γ/IL-4 比值的變化顯示優(yōu)化飼養(yǎng)的小型豬免疫平衡比常規(guī)飼養(yǎng)略向輔助性T細胞1（Th1）偏轉。免疫平衡是構成內穩(wěn)態(tài)的重要因素，通過Th1型和Th2型細胞因子的相互作用維持機體細胞免疫和體液免疫的平衡，在感染、自身免疫病、腫瘤等疾病狀態(tài)以及妊娠等特殊生理狀態(tài)中，都存在Th1/Th2偏移［7］，但機體應激對免疫平衡的影響目前尚無定論，結合應激分子的變化特點，本研究結果提示常規(guī)飼養(yǎng)中的背景性應激可能使小型豬的免疫平衡發(fā)生Th2偏移，多元福利措施具有糾正該偏移的潛在效果。

兩組的血細胞成分在紅、白兩系細胞都存在差異。紅細胞是體內主要負責運送氧氣和養(yǎng)分的血細胞, 除遺傳因素外和機體營養(yǎng)狀況關系密切, 優(yōu)化飼養(yǎng)組紅系細胞多個指標比常規(guī)飼養(yǎng)組略高，該結果與優(yōu)化飼養(yǎng)小型豬利用更大活動空間和道具表現(xiàn)出更多運動、以及營養(yǎng)干預劑的補益作用相吻合。同時, 相對于常規(guī)飼養(yǎng)組, 優(yōu)化飼養(yǎng)組循環(huán)中存在更多嗜酸性粒細胞, 該結果也與其血清中較低的皮質醇水平吻合。此外, 鑒于生態(tài)墊料中作業(yè)菌群在分解排泄物的同時為小型豬提供了一個多菌的環(huán)境, 優(yōu)化飼養(yǎng)小型豬中性粒細胞的增加推測與此有關。

本研究運用針對實驗小型豬聽覺、觸覺、嗅覺、味覺等感官特點設計的環(huán)境豐富元素并采用組合實施多種福利措施的手段，通過比較生活在“豐富”或“貧瘠”環(huán)境中的同胎小型豬在應激生物學指標和常規(guī)生理指標的差異，研究了多元福利措施對實驗小型豬整體福利的改善作用及其潛在機制，結果表明該多元福利措施可有效緩解小型豬在常規(guī)飼養(yǎng)中所存在的緊張和不適，降低應激本底，與此同時作為應激聯(lián)動指標的部分免疫學和血液學指標也會發(fā)生相應改變。基于環(huán)境豐富原理的動物福利措施的設計和應用，關鍵在于客觀評估其福利效應以及對機體基準值的影響［8,9］，該研究提示，在福利效應方面，多元福利措施具有降低小型豬日常應激本底從而提高實驗小型豬福利的確切效果和推廣應用價值，而在指標基準值方面，由于日常飼養(yǎng)應激普遍以應激本底的形式存在于動物實驗研究中，當改善動物福利的效應表現(xiàn)為降低動物應激本底時，必然引起部分免疫指標、生理生化指標等基準值的改變，對此需要結合實驗動物生物學特性和實驗具體內容分析，從而通過修正基準值為為實驗提供更科學結果判讀依據(jù)。

［1］ Ellegaard L,Cunningham A, Edwards S, et al. Welfare of the minipig with specialreference to use in regulatory toxicology studies［J］. J Pharmacol Toxicol Methods, 2010, 62（3）：167-183.

［2］ Baumans V, Van Loo PL. How to improve housing conditions of laboratory animals： the possibilities of environmental refinement［J］. Vet J, 2013, 195（1）：24-32.

［3］ Heleen A, van de Weerd, Jon EL Day. A review of environmental enrichment for pigs housed in intensive housing systems［J］. Appl Anim Behav Sci, 2009, 116（1）：1-20.

［4］ Tuyttens FAM. The importance of straw for pig and cattle welfare： A review［J］. Appl Anim Behav Sci, 2005, 92：261-282.

［6］ 唐建陽, 鄭雪芳, 劉波, 等. 微生物發(fā)酵床養(yǎng)殖方式下仔豬行為特征［J］. 畜牧與獸醫(yī), 2012, 44（4）：34-39.

［7］ Ahmad SF, Zoheir KM, Ansari MA, et al. Stimulation of the histamine 4 receptor with 4-methylhistamine modulates the effects of chronicstress on the Th1/Th2 cytokine balance［J］. Immunobiology, 2015, 220（3）：341-349.

［8］ Benefiel AC, Dong WK, Greenough WT. Mandatory “enriched” housing of laboratory animals： the need for evidence-based evaluation［J］. ILAR J, 2005, 46（2）：95-105.

［9］ Bayne K. Potential for unintended consequences of environmental enrichmen for laboratory animals and research results［J］. ILAR J, 2005, 46（2）：129-139.

［5］ Smith ME, Gopee NV, Ferguson SA. Pof minipigs for environmental enrichment objects［J］. J Am Assoc Lab Anim Sci, 2009, 48（4）：391-394.

Study on the Benefits of Multi-welfare Strategies in Minipigs

HU Ying, YANG Fei
（Department of Laboratory Animal Science， Fudan University， Shanghai 200032， China）

ObjectiveTo study improvements in well-being of minipigs with multi-welfare strategies （combine with music, aromatherapy oils, nutrients, toys, biological activity bedding）. MethodsTwelve female Bama minipigs from 6 litters were used in this study, while every 2 pigs from the same litter were divided separately into conventional group and optimized group. After 9 weeks’ rearing, the expression of stress-related molecules, immune balance, blood parameters and growth performance were measured. ResultsPigs from optimized group display lower serum cortisol level and lower IFN-γ/IL-4 as well as lower expression in GR mRNA and HSP70 mRNA, meanwhile their RBC, HGB, HCT, MCV, MCH, WBC, NEUT and EO were observed higher than those from conventional group. ConclusionMultiwelfare strategies is benefit to reduce stress lever of minipigs and enhance their anti-stress ability, meanwhile, it can also change the immune balance and blood routine.

Minipig； Stress； Environmental enrichment

Q95-33

A

1674-5817（2016）02-0121-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.02.008

2015-10-21

上海市科技發(fā)展基金項目（12140900900）

胡櫻（1973-）, 女, 高級實驗師, 研究方向： 實驗動物福利與比較醫(yī)學。E-mail： secrethy@126.com

楊斐, 男, 副研究員, 研究方向： 比較醫(yī)學與實驗動物應用。E-mail： yfdwbfd@fudan.edu.cn