綠色熒光裸小鼠睪丸組織學觀察及精子質量檢查

胡文娟, 方　天, 劉　彪, 梁　磊, 趙志剛, 賈春梅, 陳　莉, 許龍祥, 惲時鋒（南京軍區南京總醫院比較醫學科, 全軍實驗動物科普與倫理教育基地, 全國科普教育基地, 南京 210002）

綠色熒光裸小鼠睪丸組織學觀察及精子質量檢查

胡文娟, 方天, 劉彪, 梁磊, 趙志剛, 賈春梅, 陳莉, 許龍祥, 惲時鋒
（南京軍區南京總醫院比較醫學科, 全軍實驗動物科普與倫理教育基地, 全國科普教育基地, 南京 210002）

目的探討綠色熒光裸小鼠繁殖率低下的原因。方法對綠色熒光裸小鼠的睪丸及附睪進行組織病理學及精子質量檢查。比較雄性綠色熒光裸小鼠與BALB/c裸小鼠的睪丸、附睪臟器系數和精子濃度、精子活力、活率及精子畸形率； 觀察睪丸及附睪組織病理學變化。結果雄性綠色熒光裸小鼠及BALB/c裸小鼠的睪丸、附睪臟器系數、精子濃度及組織結構并無顯著差異（P＞0.05）； 但精子活力（直線運動和原地轉動及靜止不動）的構成比、活精子率及畸形率間均具有顯著差異（P＜0.05）。結論雄性綠色熒光裸小鼠精子質量（活力、活率及畸形率等方面）略為低下可能是影響綠色熒光裸小鼠繁殖性能的原因之一。

綠色熒光； 精子濃度； 精子質量； 繁殖性能

綠色熒光裸小鼠是本科室將綠色熒光蛋白GFP）基因導入BALB/c 裸小鼠而得來。GFP現已成為細胞生物學和分子生物學中應用最廣泛的分子標記之一。綠色熒光裸小鼠因自身含有標記蛋白與普通裸小鼠相比而具有明顯的優勢。但在日常繁育中, 發現綠色熒光裸小鼠與普通裸小鼠相比較, 繁殖性能較為低下，平均生產胎次及窩產仔數均低于普通裸小鼠。為查明其繁殖性能低下的原因, 作者對雄性綠色熒光裸小鼠與BALB/c裸小鼠的睪丸及附睪組織、精子質量進行檢測與比較，結果如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物

分別取8～10周齡SPF級雄性綠色熒光裸小鼠及普通BALB/c裸小鼠各10只，綠色熒光裸小鼠由本科室提供［SCXK（蘇）2012-0014］, BALB/c裸小鼠購自常州卡文斯實驗動物有限公司［SCXK（蘇）2011-0003］），實驗動物均置于無菌條件下飼養, 自由飲食, 物品嚴格滅菌處理, 保持一定的溫度與濕度。

1.2方法

1.2.1睪丸、附睪的臟器系數測定取動物稱體質量后，用水合氯醛（4%）進行麻醉，以0.2 mL/20 g腹腔注射，常規解剖后分離睪丸、附睪，及時稱重并記錄，并計算臟器系數［臟器質量（mg）/體質量（g）］。

1.2.2精子計數取一側附睪置于含生理鹽水的小燒杯中剪開，用鑷子輕輕攪動，使精子游離，用擦鏡紙過濾后加入3 mL生理鹽水（經37 ℃水浴鍋預溫）制成精子懸液。吸取二次稀釋的精子懸液，滴加于計數板與蓋玻片接觸處，使精液自然流入計數室中，按紅細胞計數法，進行精子計數。

1.2.3精子活力檢測參照文獻［1］方法，在光學顯微鏡下觀察懸液中精子的活動度, 連續計數200個精子。精子活動分3級（直線向前運動、原地轉動和靜止不動）。檢測并計算精子活力。

1.2.4精子畸變率檢測將精子懸液涂片，自然干燥, 體積分數4%甲醇固定，2%伊紅染液染色1 h,沖洗晾干。高倍鏡下作精子形態分析，每只小鼠涂片3次，每次500個精子，統計出其所含的畸形精子數，計算畸形率。

1.2.5睪丸及附睪病理組織學觀察取一側睪丸及附睪經常規HE染色制成病理標本片，在光學顯微鏡下觀察組織病理學變化。

1.3統計學處理

2　結果

2.1睪丸及附睪臟器系數

兩組雄性綠色熒光裸小鼠及BALB/c裸小鼠睪丸、附睪的臟器系數無顯著差異（P＞0.05）（表1）。

2.2精子計數、精子活力及畸形率

由表2可知，與BALB/c裸小鼠比較，綠色熒光裸小鼠的精子濃度略有降低（P＞0.05）； 直線運動和原地轉動的構成比下降，而靜止不動的構成比上升（P＜0.05）； 兩組裸小鼠的活精子率和畸形率均具有明顯差異（P＜0.05）。綠色熒光裸小鼠與BALB/c裸小鼠精子畸形觀察見圖1、2。

2.3睪丸及附睪組織病理學觀察

光學顯微鏡下可見，綠色熒光裸小鼠睪丸曲細精管排列致密有序，結構完整，曲細精管直徑與生精小管上皮的厚度正常，支持細胞與各級生精細胞形態及數量未見明顯異常，精原細胞近圓形,胞核較大, 管腔內可見精子, 睪丸被膜正常（圖3A）。BALB/c裸小鼠睪丸曲細精管生長良好, 生精細胞排列整齊, 層次清楚, 結構正常, 有明顯管腔, 細胞數量多，細胞形態未見異常（圖3B）。綠色熒光裸小鼠附睪上皮細胞排列緊密，主細胞胞質飽滿, 管腔內有大量精子, 未見異常（圖3C）。BALB/c裸小鼠附睪上皮細胞排列有序, 管腔面有細長靜纖毛, 腔內可見大量精子（圖3D）。由此可見, 綠色熒光裸小鼠睪丸及附睪組織結構并未發生病理變化, 與BALB/c裸小鼠的睪丸及附睪組織結構相似, 并未查見明顯改變。

表1　綠色熒光裸小鼠睪丸系數、附睪系數檢測

表2　綠色熒光裸小鼠附睪精子密度和精子質量的檢測

圖1　BALB/c裸小鼠精子畸形（HE×200）　

圖2　綠色熒光裸小鼠精子畸形（HE×200）

3　討論

綠色熒光蛋白小鼠的啟動子為β-actin, 它在維持細胞結構、細胞分裂等細胞生理活動方面發揮著重要作用，因而綠色熒光蛋白也可以隨著細胞的分裂而表達［2］。肖紅衛等［3］研究表明，綠色熒光蛋白并未隨綠色熒光蛋白小鼠的傳代而發生明顯消退。李甫強等［4］研究表明，在綠色熒光蛋白小鼠的骨髓間充質干細胞（BMSCs）原代培養中，當BMSCs傳5代時在熒光顯微鏡下仍帶有綠色熒光表達，說明在傳代過程中綠色熒光蛋白基因能穩定表達。

本實驗對雄性綠色熒光蛋白裸小鼠與BALB/c裸小鼠的精子, 精子發生部位（睪丸）, 以及精子發育、成熟部位（附睪）進行了觀察與相關檢測。結果顯示,雄性綠色熒光蛋白裸小鼠及BALB/c裸小鼠的睪丸、附睪臟器系數并無顯著差異（P＞0.05）； 雄性BALB/c裸小鼠精子濃度比綠色熒光蛋白雄性裸小鼠略高, 但差異無統計學意義（P＞0.05）； 雄性綠色熒光蛋白裸小鼠精子的直線運動和原地轉動的構成比較BALB/c裸小鼠均有所下降, 而靜止不動的構成比略有上升, 數據之間差異具有統計學意義（P＜0.05）； 雄性綠色熒光蛋白裸小鼠的活精子率明顯低于雄性BALB/c裸小鼠的活精子率（P＜0.05）； 雄性綠色熒光蛋白裸小鼠精子畸形率較高，與雄性BALB/c裸小鼠差異明顯P＜0.05）。光鏡下可見, 綠色熒光蛋白裸小鼠與BALB/c裸小鼠的睪丸及附睪組織結構并無明顯差異。由檢測數據分析, 顯示雄性綠色熒光蛋白裸小鼠的睪丸、附睪臟器系數及睪丸、附睪的組織結構并未對其繁殖性能造成顯著的影響, 其精子活力、活率及畸形率等方面水平低下更有可能影響了綠色熒光蛋白裸小鼠的繁殖性能, 從而使其繁殖性能下降。研究表明，日常繁育中綠色熒光蛋白裸小鼠的繁殖率較BALB/c裸小鼠低下，可能是由于雄性綠色熒光蛋白裸小鼠的精子質量（活力、活率及畸形率等方面）有所下降，影響了其生殖功能。

圖3　裸小鼠睪丸及附睪組織病理學觀察

［1］余同輝, 吳人亮, 甘亞平, 等. 三苯氧胺對小鼠精子的毒性作用［J］. 華中科技大學學報： 醫學版, 2006, 35（1）：107-109.

［2］夏來新, 程漢華, 郭一清, 等. 黃鱔β-actin基因的克隆及其在魚類中的系統發生分析［J］. 遺傳學報, 2005, 32（7）：689-695.

［3］肖紅衛, 鄭新, 劉中華, 等. 綠色熒光蛋白基因轉基因小鼠傳代中的生物學觀察［C］. 第15次全國動物遺傳育種學術討論會論文集.陜西楊凌： 中國畜牧獸醫學會, 1999：209.

［4］李甫強, 周鴻鷹, 羊惠君, 等. 差速貼壁法純化分離綠色熒光轉基因小鼠骨髓間充質干細胞［J］. 四川大學學報： 醫學版, 2006, 37（2）：301-304.

Q95-33

A

1674-5817（2016）02-0126-03

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.02.009

2015-10-12

胡文娟（1990-）, 女, 技師, 從事裸小鼠的育種與科研。E-mail： 452665670@qq.com

惲時鋒（1965-）, 男, 教授, 從事醫學實驗動物學。E-mail： yunshifeng1@163.com