糖皮質激素對哮喘氣道重塑大鼠骨橋蛋白水平及骨橋蛋白mRNA表達的影響

雷 琳，陳培芬，李國保，傅向東，劉 智，張香梅

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糖皮質激素對哮喘氣道重塑大鼠骨橋蛋白水平及骨橋蛋白mRNA表達的影響

雷 琳，陳培芬，李國保，傅向東，劉 智，張香梅

目的探討糖皮質激素對哮喘氣道重塑大鼠骨橋蛋白(OPN)水平及OPN mRNA表達的影響。方法2014年12月—2016年1月，選取30只雄性Wistar大鼠并采用隨機數字表法分為正常對照組、哮喘模型組、糖皮質激素組，各10只。建立哮喘動物模型，哮喘模型組大鼠于造模第15天予以卵清蛋白(OVA)霧化吸入激發致敏；正常對照組大鼠于造模第15天予以等量0.9%氯化鈉溶液腹腔注射及霧化吸入；糖皮質激素組大鼠處理同哮喘模型組，并于OVA霧化吸入激發致敏前1 h霧化吸入布地奈德混懸液(BUD)。比較3組大鼠氣道壁厚度，支氣管壁平滑肌厚度及胰島素樣生長因子-I(IGF-I)、神經生長因子(NGF)、核因子-κB(NF-κB)水平，OPN水平及OPN mRNA表達情況，并進行相關性分析。結果哮喘模型組大鼠氣道壁厚度、支氣管壁平滑肌厚度大于糖皮質激素組和正常組對照組(P<0.05)；糖皮質激素組大鼠氣道壁厚度、支氣管壁平滑肌厚度大于正常組對照組(P<0.05)。哮喘模型組大鼠IGF-I、NGF、NF-κB水平高于糖皮質激素組和正常組對照組(P<0.05)；糖皮質激素組大鼠IGF-I、NGF、NF-κB水平高于正常組對照組(P<0.05)。哮喘模型組大鼠OPN水平和OPN mRNA相對表達量高于糖皮質激素組和正常組對照組(P<0.05)；糖皮質激素組大鼠OPN水平和OPN mRNA相對表達量高于正常組對照組(P<0.05)。哮喘氣道重塑大鼠氣道壁厚度、支氣管壁平滑肌厚度及IGF-I、NGF、NF-κB水平分別與OPN水平(r值分別為0.91、0.84、0.80、0.79、0.83)、OPN mRNA相對表達量(r值分別為0.83、0.87、0.79、0.76、0.81)呈正相關(P<0.05)。結論糖皮質激素可抑制哮喘大鼠氣道重塑的發生，延緩氣道壁及支氣管壁平滑肌增厚，降低IGF-I、NGF、NF-κB、OPN水平及OPN mRNA的表達。

氣道重塑；糖皮質激素類；大鼠，Wistar；骨橋蛋白質；mRNA

雷琳，陳培芬，李國保，等.糖皮質激素對哮喘氣道重塑大鼠骨橋蛋白水平及骨橋蛋白mRNA表達的影響[J].實用心腦肺血管病雜志，2016，24(8)：54-58.[www.syxnf.net]

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支氣管哮喘(哮喘)是由多種細胞和細胞組共同參與的氣道炎癥，氣道重塑是其典型表現之一[1]。研究表明，氣道重塑發生于哮喘早期，呈慢性、進行性發展，可導致肺功能下降[2]。預防和逆轉氣道重塑在哮喘的治療中具有積極作用，可有效改善患者肺功能。骨橋蛋白(OPN)是一種細胞外基質蛋白，其可與不同受體結合發揮多種生物效應，可導致氣道炎癥、細胞外基質沉積等。有研究表明，OPN是一種潛在的促炎性因子，可參與哮喘氣道重塑[3]。糖皮質激素是臨床治療哮喘的一線藥物，可改善患者氣道炎癥，緩解患者臨床癥狀。目前，糖皮質激素對哮喘氣道重塑患者OPN及其mRNA表達的影響尚不明確。布地奈德混懸液(BUD)是一種新型吸入糖皮質激素，其抗炎作用是二丙酸倍氯松的2倍，可通過調控炎癥、細胞因子、抑制黏液腺肥大而參與氣道重塑，臨床應用廣泛。本研究旨在探討糖皮質激素對哮喘氣道重塑大鼠OPN水平及OPN mRNA表達的影響，現報道如下。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物選取SPF級健康雄性Wistar大鼠30只，周齡7～11周，平均周齡(8.2±1.1)周；體質量160～200 g，平均體質量(182.6±4.1)g；購自廣東省醫學實驗動物中心，動物合格證號：粵檢證字第2002A008號；實驗前1周飼養于動物實驗中心動物房；飼養條件：室溫22～28 ℃，相對濕度40%～70%，日光燈采光，12 h暗室，12 h光照，自由攝食、飲水。

1.1.2實驗試劑卵清蛋白(OVA)購自Sigma公司，BUD購自澳大利亞Astra Zenexa公司，胰島素樣生長因子I(IGF-I)兔抗大鼠單克隆抗體購自武漢博士德生物公司，神經生長因子(NGF)抗體試劑盒購自武漢博士德生物公司，氫氧化鋁干粉購自上海生物制品研究，小鼠抗大鼠OPN單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，核因子κB(NF-κB)亞單位兔抗大鼠單克隆抗體購自武漢博士德生物公司。

1.1.3實驗儀器霧化吸入裝置由上海化工機械廠有限公司提供，引物合成裝置由上海生物工程技術有限公司提供。

1.2實驗方法

1.2.1建立模型將OVA 100 mg和氫氧化鋁干粉200 mg加入0.9%氯化鈉溶液1 ml中配置成抗原溶液，實驗第1天和第8天于大鼠腹腔內注射1.5 ml抗原溶液致敏，獲得大鼠哮喘動物模型。

1.2.2分組2014年12月—2016年1月，采用隨機數字表法將大鼠分為正常對照組、哮喘模型組、糖皮質激素組，各10只。(1)哮喘模型組大鼠于造模第15天予以OVA霧化吸入激發致敏，30 min/次，隔天1次，共8周。(2)正常對照組大鼠于造模第15天予以等量0.9%氯化鈉溶液代替抗原液、霧化吸入液等進行腹腔注射及霧化吸入。(3)糖皮質激素組大鼠處理同哮喘模型組，并于OVA霧化吸入激發致敏前1 h霧化吸入BUD 4 mg/8 ml。

1.2.3標本采集各組大鼠于末次激發12 h經腹腔注射10%水合氯醛4 ml/kg麻醉，打開胸腔，取右肺肺門上段肺組織，置入4%多聚甲醛固定，送入病理科常規包埋、切片、HE染色。

1.3觀察指標比較3組大鼠氣道壁厚度、支氣管壁平滑肌厚度，IGF-I、NGF、NF-κB水平，OPN水平和OPN mRNA表達情況，并進行相關性分析。

1.3.1氣道壁厚度和支氣管平滑肌厚度測量方法HE染色切片置于100倍光鏡下，選內徑<0.2 nm且橫斷面完整的小支氣管，測量小氣道周長(Pi)及最大直徑上兩個管壁厚度(T1、T2)，氣道壁厚度=(T1+T2)/Pi；于40倍光鏡下選取完整的無軟骨中小支氣管橫斷面，采用醫學圖像分析系統進行圖像采集，采用熒光筆描繪支氣管基底膜周徑(Pbm)、支氣管平滑肌面積(Wam)，并將測得數據標準化，支氣管壁平滑肌厚度=Pbm/Wam。

1.3.2IGF-I、NGF、NF-κB水平檢測方法采用免疫組化法檢測氣道上皮細胞IGF-I、NGF、NF-κB水平，IGF-I、NGF陽性染色均為黃褐色顆粒，NF-κB陽性染色為棕褐色顆粒，主要存在于上皮細胞的胞質中。隨機選取5個小支氣管切片，直徑為100～200 μm，置于40倍光鏡下觀察，采用平均光密度值表示抗原表達量。

1.3.3OPN水平和OPN mRNA的表達采用免疫組化法檢測肺組織OPN水平，嚴格按檢測步驟進行切片、脫蠟、孵育、DAB染色，顯微鏡F觀察，呈陽性后采用水充分沖洗，蘇木素染色1 min，沖洗，0.5%～1.0%乙醇分化30 s，直至鏡下可見胞核和核內染色，乙醇脫水，封片；鏡下觀察細胞呈棕黃色為陽性，采用圖像分析軟件測定陽性部位平均光密度，并取平均值。采用反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)測定肺組織OPN mRAN表達情況，采用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作內參，內參長度為288 bp。上游引物：5′-TGCTGAGTACGTGGAG-3′；下游引物：5-TCGTGAGTACGTGGAGGTCTTCT-GAGTGGCAGTGAT-3′；OPN mRNA產物長度145 bp，上游引物：5′-CCAAGGAC-CAACTACAACC-3′；下游引物：5-TGCTGAGTACGTGGAGGTCTTCT-GAGTGGCAGTGAT-3′；擴增后得到相應目的基因片段，分析并測定每個目的基因及GAPDH的A450nm值，以其A450nm吸光度值表示基因相對表達量。

2　結果

2.1哮喘癥狀哮喘模型組大鼠激發第3天出現呼吸頻率加快、面部發紺、行動遲緩等，部分大鼠聞及響亮呼吸音，口鼻有黏液流出，反復激發后大鼠毛色失光滑、反應遲鈍；正常對照組大鼠無異常反應，正常生長；糖皮質激素組大鼠哮喘樣癥狀較輕，且相對活躍。

2.2肺組織形態哮喘模型組大鼠肺組織經HE染色后于鏡下觀察發現，肺組織結構破壞，支氣管周圍有大量淋巴細胞、漿細胞等細胞浸潤(見圖1)，支氣管管壁、平滑肌明顯增厚，管腔狹窄；正常對照組大鼠支氣管、肺泡等結構基本正常，支氣管管腔內無炎性滲出物和炎性細胞浸潤，未出現支氣管管壁、平滑肌增厚；糖皮質激素組大鼠肺泡結構基本正常，支氣管浸潤和支氣管管壁、平滑肌增厚，但增厚程度較哮喘模型組輕。

2.3氣道壁厚度、支氣管壁平滑肌厚度3組大鼠氣道壁厚度、支氣管壁平滑肌厚度比較，差異有統計學意義(P<0.05)；哮喘模型組大鼠氣道壁厚度、支氣管壁平滑肌厚度大于糖皮質激素組和正常組對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；糖皮質激素組大鼠氣道壁厚度、支氣管壁平滑肌厚度大于正常組對照組，差異有統計學意義(P<0.05，見表1)。

Table1Comparisonofairwaywallthicknessandbronchialsmoothmusclethicknessamongthethreegroups

注：與正常對照組比較，aP<0.05，與糖皮質激素組比較，bP<0.05

2.4IGF-I、NGF、NF-κB3組大鼠IGF-I、NGF、NF-κB水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)；哮喘模型組大鼠IGF-I、NGF、NF-κB水平高于糖皮質激素組和正常組對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；糖皮質激素組大鼠IGF-I、NGF、NF-κB水平高于正常組對照組，差異有統計學意義(P<0.05，見表2)。

表2　3組大鼠IGF-I、NGF、NF-κB水平比較

注：與正常對照組比較，aP<0.05，與糖皮質激素組比較，bP<0.05；IGF-I=胰島素樣生長因子I，NGF=神經生長因子，NF-κB=核因子κB

2.5OPN水平和OPN mRNA相對表達量3組大鼠OPN水平和OPN mRNA相對表達量比較，差異有統計學意義(P<0.05)；哮喘模型組大鼠OPN水平和OPN mRNA相對表達量高于糖皮質激素組和正常組對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；糖皮質激素組大鼠OPN水平和OPN mRNA相對表達量高于正常組對照組，差異有統計學意義(P<0.05，見表3)。

Table3ComparisonofOPNandrelativeexpressionquantityofOPNmRNAamongthethreegroups

組別只數OPN(μg/L)OPNmRNA正常對照組100.17±0.020.39±0.07糖皮質激素組100.35±0.03a0.70±0.04a哮喘模型組100.50±0.047ab1.00±0.05abF值8.64210.949P值0.0000.000

注：與正常對照組比較，aP<0.05，與糖皮質激素組比較，bP<0.05；OPN=骨橋蛋白

2.6相關性分析大鼠氣道壁厚度、支氣管壁平滑肌厚度及IGF-I、NGF、NF-κB水平分別與OPN水平(r值分別為0.91、0.84、0.80、0.79、0.83)、OPN mRNA相對表達量(r值分別為0.83、0.87、0.79、0.76、0.81)呈正相關(P<0.05)。

3　討論

目前，哮喘的發病機制尚不明確，以往臨床認為可逆性氣流阻塞是哮喘的主要特征，但隨著對哮喘的深入研究發現，哮喘患者緩解期也存在肺功能低下。近年來，氣道重塑在哮喘患者肺功能損傷中的作用受到臨床醫師的廣泛關注，其呈慢性、漸進性發展，常伴隨基底膜改變、氣道平滑肌增厚等，故防治氣道重塑是臨床治療哮喘的重點。

NGF屬于神經營養蛋白家族，具有調節神經元生長，修復受損神經元的作用。有報道指出，NGF可誘導過敏反應[4]。有研究表明，氣道重塑過程中可能有NGF的作用靶細胞，即結構細胞[5]。NGF通過誘導血管內皮生長因子釋放而促進內皮細胞增殖、遷移，從而增加血管通透性；成纖維細胞遷移、分化為肌成纖維細胞可導致膠原沉積。IGF-I可促進人體多種細胞增殖、分化，使上皮中的成纖維細胞增殖，并參與氣道重塑；激活Rho激酶途徑，使支氣管細胞呈慢性、進行性收縮，導致氣道狹窄。NF-κB可調節炎性蛋白基因的轉錄，通過調控細胞因子、炎性因子、細胞間黏附分子而誘導氣道重塑[6]。管頻等[7]研究發現，NF-κB表達水平升高可導致氣道重塑，加重肺功能損傷。李衛衛等[8]研究表明，NF-κB參與氣道慢性炎性反應、成纖維細胞增殖。

OPN是一種是多功能細胞因子，嗜酸粒細胞、中性粒細胞、上皮細胞中均存在其受體，OPN與受體結合后可促使細胞增殖、分化，導致新生血管大量增生，基底膜明顯增厚。國外研究表明，OPN缺乏可幫助小鼠拮抗OVA誘導的氣道高反應，可能與抑制黏膜下炎性細胞浸潤有關[9]。KOHAN等[10]通過體外培養OPN和正常小鼠成纖維細胞發現，OPN可抑制成纖維細胞遷移。

糖皮質激素是臨床治療哮喘的有效藥物之一，可控制氣道炎癥、減少細胞浸潤、改善支氣管擴張、有效緩解哮喘癥狀。吸入糖皮質激素是常用的給藥方式，可使藥物直接作用于病灶，增加局部藥物濃度，減少用藥劑量，避免全身給藥引起的多種不良反應。目前，臨床采用糖皮質激素治療哮喘的臨床療效確切[11]。邱容等[12]將90例哮喘緩解期患者分為對照組與觀察組，對照組患者予以常規治療，觀察組患者在對照組基礎上加用布地奈德治療，結果顯示，觀察組患者炎性細胞水平明顯降低，肺功能明顯改善。有研究表明，早期予以糖皮質激素治療在預防哮喘氣道重塑中具有積極作用[13]。江麗娜等[14]研究發現，吸入布地奈德可通過下調NF-κB、基質金屬蛋白酶-9而抑制氣道重塑。

本研究結果顯示，哮喘模型組大鼠氣道壁厚度、支氣管壁平滑肌厚度大于糖皮質激素組和正常組對照組，糖皮質激素組大鼠氣道壁厚度、支氣管壁平滑肌厚度大于正常組對照組；哮喘模型組大鼠IGF-I、NGF、NF-κB水平高于糖皮質激素組和正常組對照組，糖皮質激素組大鼠IGF-I、NGF、NF-κB水平高于正常組對照組；哮喘模型組大鼠OPN水平和OPN mRNA相對表達量高于糖皮質激素組和正常組對照組，糖皮質激素組大鼠OPN水平和OPN mRNA相對表達量高于正常組對照組；氣道壁厚度、支氣管壁平滑肌厚度及IGF-I、NGF、NF-κB水平分別與OPN水平、OPN mRNA相對表達量呈正相關。說明NGF、IGF-I、NF-κB參與了哮喘氣道重塑，OPN在哮喘氣道重塑過程中具有重要作用，而BUD可通過降低IGF-I、NGF、NF-κB、OPN水平及OPN mRNA相對表達量而抑制氣道重塑的發生。

綜上所述，糖皮質激素可抑制哮喘大鼠氣道重塑的發生，延緩氣道壁及支氣管壁平滑肌增厚，降低IGF-I、NGF、NF-κB、OPN水平及OPN mRNA的表達，具有一定的參考價值。

作者貢獻：雷琳、李國保、傅向東進行實驗設計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負責；陳培芬、傅向東、劉智、張香梅進行實驗實施、評估、資料收集；李國保進行質量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：李潔晨)

Impact of Glucocorticoids on Expressions of Osteopontin and Osteopontin mRNA of Asthma Rats with Airway Remodeling.

LEILin，CHENPei-fen，LIGuo-bao，FUXiang-dong，LIUZhi，ZHANGXiang-mei..

TheThirdDepartmentofPulmonaryMedicine，theThirdPeople′sHospitalofShenzhen，Shenzhen518112，China

ObjectiveTo investigate impact of glucocorticoids on expressions of osteopontin(OPN)and osteopontin mRNA(OPN mRNA)of asthma rats with airway remodeling.MethodsFrom December 2014 to January 2016，a total of 30 male Wistar rats were selected and divided into A group，B group and C group according to random number table，each of 10 rats.Animal model of asthma was prepared，rats of B group received aerosol inhalation of ovalbumin(OVA)to stimulate the sensitization on the 15th day of preparation of asthma model，meanwhile rats of A group received equivalent 0.9% sodium chloride injection，while rats of C group received aerosol inhalation of budesonide suspension 1 hour before aerosol inhalation of OVA.Airway wall thickness，bronchial smooth muscle thickness，IGF-I，NGF，NF-κB，OPN and expression of OPN mRNA were compared among the three groups，and their correlations were analyzed.ResultsAirway wall thickness and bronchial smooth muscle thickness of B group were statistically significantly larger than those of A group and C group(P<0.05)；meanwhile airway wall thickness and bronchial smooth muscle thickness of C group were statistically significantly larger than those of A group(P<0.05).IGF-I，NGF and NF-κB of B group were statistically significantly higher than those of A group and C group(P<0.05)；meanwhile IGF-I，NGF and NF-κB of C group were statistically significantly higher than those of A group(P<0.05).OPN and relative expression quantity of OPN mRNA of B group were statistically significantly higher than those of A group and C group(P<0.05)；meanwhile OPN and relative expression quantity of OPN mRNA of C group were statistically significantly higher than those of A group(P<0.05).Of asthma rats with airway remodeling，airway wall thickness，bronchial smooth muscle thickness，IGF-I，NGF，NF-κB was positively correlated with OPN，respectively(r=0.91，0.84，0.80，0.79，0.83)，was also positively correlated with relative expression quantity of OPN mRNA，respectively(r=0.83，0.87，0.79，0.76，0.81)(P<0.05).ConclusionGlucocorticoids can inhibit the occurrence of airway remodeling of rats with asthma，delay the incrassation of airway wall and bronchial smooth muscle，reduce the IGF-I，NGF，NF-κB，OPN and expression of OPN mRNA.

Airway remodeling；Glucocorticoids；Rats，Wistar；Osteopontin；mRNA

廣東省醫學科研基金立項課題(A2014639)

518112廣東省深圳市第三人民醫院肺三科(雷琳，李國保，傅向東，劉智)，內二科(陳培芬)，病理科(張香梅)

R 332

A

10.3969/j.issn.1008-5971.2016.08.014

2016-05-05；

2016-08-11)