熒光PCR-熔解曲線法檢測新疆回族人群CYP2C9和VKORC1基因多態性研究

柴樹紅，陳　麗，谷　苞，唐麗紅，員　靜，程瑞雪，張中滿，張穎芬

(1.新疆維吾爾自治區烏魯木齊市友誼醫院檢驗科　830000；2.廣州好芝生物科技有限公司，廣州 510663)

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·論著·

熒光PCR-熔解曲線法檢測新疆回族人群CYP2C9和VKORC1基因多態性研究

柴樹紅1，陳麗1，谷苞1，唐麗紅1，員靜1，程瑞雪1，張中滿2，張穎芬2

(1.新疆維吾爾自治區烏魯木齊市友誼醫院檢驗科830000；2.廣州好芝生物科技有限公司，廣州 510663)

目的應用熒光PCR-熔解曲線法檢測新疆回族人群細胞色素P450酶2C9(CYP2C9)和維生素K環氧化物還原酶復合體亞單位1(VKORC1)基因多態性，研究新疆回族人群CYP2C9和VKORC1基因分布及基因突變頻率情況，并評價熒光PCR-熔解曲線法臨床使用的適用性。方法采用熒光PCR-熔解曲線法和測序法對比檢測CYP2C9*2、CYP2C9*3和VKORC1(-1639G/A)的基因多態性。結果228例新疆回族人群中，共檢測出CYP2C9*1/*1標本199例，CYP2C9*1/*2標本2例，CYP2C9*1/*3標本26例，CYP2C9*3/*3標本1例，未檢測出CYP2C9*2/*2和CYP2C9*2/*3標本。VKORC1(-1639G/A)檢測出2種等位基因G和A，其中VKORC1-1639G/G型標本檢出2例，VKORC1-1639G/A型標本檢出39例，VKORC1-1639A/A型標本檢出187例，與測序法對比檢測比較，熒光PCR-熔解曲線法與測序法檢測結果完全一致。結論新疆回族人群同樣具有CYP2C9基因*2、*3位點和VKORC1基因-1639位點的多態性，其發生頻率與新疆維吾爾族及其他地域人群的具有一定差異，所采用的熒光PCR-熔解曲線法用于基因多態性檢測可滿足臨床檢測要求。

新疆回族；基因多態性；細胞色素P450酶2C9；維生素K環氧化物還原酶復合體亞單位1

華法林屬香豆素類口服抗凝血藥，是用于治療血液栓塞性疾病的一線藥物，其治療窗口窄，很小的劑量變化都有可能導致嚴重不良反應。代謝華法林的酶、轉運蛋白、受體和其他華法林靶蛋白的遺傳多態性等因素均對華法林的療效產生直接或間接的影響。隨著藥物遺傳學的研究深入，越來越多的研究證實細胞色素P450酶2C9(CYP2C9)和維生素K環氧化物還原酶復合體亞單位1(VKORC1)基因多態性是造成華法林用量個體化差異的主要的遺傳因素[1-3]。

華法林在肝臟的代謝依賴于細胞色素P450，其中CYP2C9是S-華法林的主要代謝酶。目前發現CYP2C9有50多個多態性位點，其中與華法林代謝最密切相關的是CYP2C9*2(430C/T，rs1799853)和CYP2C9*3(1075A/C，rs1057910)這兩個多態性位點。攜帶CYP2C9*2或*3這兩種等位基因的患者相對于野生型(CYP2C9*1)患者華法林劑量應減少[4]。VKORC1是維生素K循環中的關鍵酶，華法林是通過抑制該酶而阻斷維生素K以輔助因子形式參與羧化酶的催化反應，抑制凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的功能活性，從而發揮抗凝作用。國內外大量研究發現，在VKORC1編碼區和非編碼區存在大量多態性位點，其中影響華法林使用的單核苷酸多態性位點主要是啟動子區-1639G/A[5-6]。本文采用熒光PCR-熔解曲線法檢測技術對新疆回族人群CYP2C9和VKORC1基因多態性進行檢測，并應用測序法對比檢測以評價該方法的靈敏度和特異度。本文所檢測的新疆回族人群CYP2C9和VKORC1基因多態性，將為新疆地區回族人群的華法林個體化用藥提供遺傳學理論數據。

1　資料與方法

1.1一般資料烏魯木齊市友誼醫院檢驗科收集的228例新疆回族人群乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝血液標本，要求各標本人群無血緣關系，其中男85例，女143例，年齡1～88歲。

1.2儀器與試劑羅氏公司LightCycler?480熒光PCR儀、美國ABI公司3130XL測序儀、血液基因組DNA提取試劑盒(貨號DTK-250，廣州好芝生物科技有限公司)、基因多態性檢測試劑盒(廣州好芝生物科技有限公司)。Taq酶(5 U/μL，PCR buffer，Mg2+，美國ABI公司)，脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP,25 mmol/L，美國ABI公司)、CYP2C9*2-測序引物SF/SR、CYP2C9*3-測序引物SF/SR、VKORC1-測序引物SF/SR引物合成均由上海生工生物工程技術有限公司合成。

1.3方法

1.3.1血液基因組DNA的提取收集2～4 mL經EDTA抗凝的外周血標本，取200 μL外周血液標本，使用廣州好芝生物科技有限公司生產的血液基因組DNA提取試劑盒按說明書進行操作，提取的DNA于-20 ℃保存備用。

1.3.2基因多態性的檢測(1)熒光PCR-熔解曲線法檢測基因多態性。采用廣州好芝生物科技有限公司生產的人CYP2C9和VKORC1基因多態性檢測試劑盒，每個標本均需進行3個PCR反應，分別對應檢測CYP2C9*2、CYP2C9*3和VKORC1(-1639)位點，每個反應體系總體積都是25 μL，每反應均由擴增試劑20 μL，DNA模板5 μL組成。擴增條件：UNG酶處理50 ℃，2 min；95 ℃預變性5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸15 s，45個循環；95 ℃持續30 s，40 ℃持續30 s，45～75 ℃進入熔解曲線熒光采集步驟。具體操作參照說明書進行。(2)測序法檢測基因多態性。CYP2C9*2、CYP2C9*3和VKORC1測序反應條件，每個反應體系總體積都是25 μL，含擴增試劑20 μL(含Hot start Taq酶、dNTPs)，各型別引物CYP2C9*2-測序引物SF/SR、CYP2C9*3-測序引物SF/SR、VKORAC1-測序引物SF/SR)，DNA模板5 μL。擴增條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，45個循環；72 ℃ 2 min。擴增產物用于測序檢測。

1.4結果判讀熒光PCR-熔解曲線法檢測基因多態性結果判讀：對于每個靶點，陽性對照會顯示2個熔解峰，Tm值較低的熔解峰指示該靶點野生型序列，Tm值較高的熔解峰指示該靶點突變型序列。若標本的熔解峰與陽性對照一致(熔解峰Tm在所示偏差范圍內)，則為雜合型；若標本的熔解峰為單峰，并且與陽性對照Tm值較低的熔解峰一致，則為純合野生型；若標本的熔解峰為單峰，并且與陽性對照Tm值較高的熔解峰一致，則為純合突變型。具體判讀標準按說明書要求進行。

1.5統計學處理采用SPSS19.0軟件進行統計處理，計數資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2　結　　果

熒光PCR-溶解曲線法結果判讀要求野生純合和突變純合型都是單峰，突變純合型Tm值高于野生純合型，雜合型為雙峰，見圖1。228例標本經測序驗證與熒光PCR-熔解曲線對比，結果100%一致。本研究通過對228例新疆回族人群CYP2C9*2、CYP2C9*3位點檢測，共發現2例CYP2C9*1/*2雜合突變型，其中男性和女性各占1例；發現26例CYP2C9*1/*3雜合型突變，其中男性11例，女性15例；發現1例女性為CYP2C9*3/*3突變純合標本；其余199例為CYP2C9*1/*1野生標本。本研究中沒有發現CYP2C9*2/*2突變純合標本和CYP2C9*2/*3雜合標本。VKORC1基因(-1639位點)檢測，共發現187例AA型，其中男性69例，女性118例；GA型39例，其中男性15例，女性24例；野生型GG型共2例，其中男、女性各1例。經χ2檢驗，新疆回族人群CYP2C9等位基因及基因頻率分布符合Hard-Weinberg平衡定律(P>0.05)，具有群體代表性。見表1、2。

圖1　　純合野生型、雜合型和純合突變型的熔解峰示例

性別n*1/*1*1/*2*1/*3*2/*2*2/*3*3/*3男性8573(85.88)1(1.18)11(12.94)0(0.0)0(0.0)0(0.0) 女性143126(88.11)1(0.70)15(10.49)0(0.0)0(0.0)1(0.70)合計228199(87.28)2(0.88)26(11.40)0(0.0)0(0.0)1(0.44)

表2　　VKORC1不同性別各基因型檢出率[n(%)]

3　討　　論

影響個體適用華法林用藥劑量的因素包括有遺傳因素和非遺傳因素，在遺傳因素中基因多態性占據重要地位。CYP2C9和VKORC1基因的多態性位點直接影響華法林在個體中所起的療效。研究表明個體有CYP2C9*2、CYP2C9*3等位基因，以及VKORC1基因(-1639位點)A等位基因的人群華法林用藥劑量應比健康人群使用劑量減少。2007年8月美國食品藥品監督管理局(FDA)建議加入藥物遺傳學信息來預測華法林的用量；2010年1月FDA建議檢測CYP2C9和VKORC1基因型具體信息以更準確地預測華法林的個體化劑量。本研究基于新疆回族人群進行基因多態性的檢測，發現基因型發生頻率與不同民族/地區人群均有某程度上的差異，對評估新疆回族人群華法林臨床使用劑量將有一定的臨床意義。

經研究新疆回族人群CYP2C9和VKORC1基因多態性，通過查閱文獻資料與國內其他民族及亞洲其他地區人群基因發生率比較，顯示其分布有一定的人群和地域差異。新疆回族人群與哈薩克族在CYP2C9基因*2、*3位點的多態性發生頻率上差異無統計學意義(P>0.05)[7]，但與漢族[6,8]，以及維族[7]，差異有統計學意義(P<0.05)。在VKORC1基因-1639位點多態性發生頻率的比較上，新疆回族人群與漢族差異無統計學意義(P>0.05)[6]，但與維族和哈薩克族差異有統計學意義(P<0.05)[7,9]。

與東亞的日本、韓國，東南亞的泰國、印度尼西亞和印度，以及西亞的伊朗、以色列和阿曼人群相比[10-11]，新疆回族人群的CYP2C9基因多態性發生頻率，差異均有統計學意義(P<0.05)。印度、伊朗、以色列和阿曼的CYP2C9*2等位基因檢出率較高，印度和以色列的CYP2C9*3等位基因檢出率較高，而日本、韓國、泰國和印度尼西亞的這兩種等位基因的檢出率都很低，這是造成差異的主要原因。對于VKORC1基因(-1639位點)，新疆回族人群與日本、韓國人群沒有明顯差異，但與泰國、印度尼西亞、印度、伊朗和阿曼則差異有統計學意義(P<0.05)。其中與印度的差異最大，印度人群主要為VKORC1基因(-1639位點)GG型，基因型發生率達到74.88%，而本研究的新疆回族僅為0.88%，差異有統計學意義(P<0.05)。

在基因多態性研究領域，檢測手段各種各樣，包括基因測序法、熒光PCR法以及芯片雜交法等[6-9]。基因測序法操作繁瑣，成本相對較高，檢測流程時間長，一般出檢測報告需要一至數天，不適宜大規模的推廣。熒光PCR法成本相對較高，需要多色熒光探針進行區分各突變位點，特異度需要嚴格控制。芯片雜交法，檢測流程相對較長，需要PCR后進行開蓋雜交，有潛在的污染風險。本研究中所使用的熒光PCR-熔解曲線法與以上方法相比有一定的優勢，單管檢測一個位點，依據熔解峰的個數和Tm值判讀結果，操作簡單、結果判讀容易、檢測流程短、不需要開管。本研究所用的方法與測序法對比檢測，檢測結果一致性為100%，適合臨床上推廣使用。

綜上所述， CYP2C9和VKORC1基因多態性是影響華法林使用劑量的主要的遺傳因素，本研究結果可為華法林臨床個體化用藥提供遺傳學數據。

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Study on fluorescence PCR-melting curve method for detecting CYP2C9 and VKORC1 gene polymorphism in Xinjiang Hui population*

CHAIShuhong1,CHENLi1,GUBao1,TANGLihong1,YUANJing1,CHENGRuixue1,ZHANGZhongman2,ZHANGYingfen2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,UrumqiMunicipalFriendshipHospital,Urumqi,Xinjiang830000China;2.Helixgen(Guangzhou)Co.,Ltd,Guangzhou,Guangdong510663,China)

ObjectiveTo use the fluorescence PCR-melting curve method to detect CYP2C9 and VKORC1 gene polymorphism in Xinjiang Hui population,to analyze their gene distribution and gene mutation frequency,and to evaluate the clinical applicability of the fluorescence PCR-melting curve method.MethodsThe fluorescence PCR-melting curve method and sequencing method were adopted to contrastively detect CYP2C9*2,CYP2C9*3 and VKORC1(-1639G/A)gene polymorphism.ResultsAmong detected 228 Xinjiang Hui individuals,199 cases of CYP2C9*1/*1,2 cases of CYP2C9*1/*2,26 cases of CYP2C9*1/*3 and only 1 case of CYP2C9*3/*3 were detected,no case of CYP2C9*2/*2 and CYP2C9*2/*3 was detected.Two kinds of allele G and A were detected for VKORC1(-1639G/A),in which VKORC1-1639G/G type was detected in 2 cases,VKORC1-1639G/A type was detected in 39 cases and VKORC1-1639A/A type was detected in187 cases,compared with the sequencing method,the results of the fluorescence PCR- melting curve method were completely consistent.ConclusionXinjiang Hui population also has CYP2C9 gene *2,*3 loci and VKORC1 gene(-1639G/A) locus polymorphism,their occurrence frequency has a certain difference with Xingjiang Uygur and other regional populations,the adopted fluorescence PCR-melting curve method used in the gene polymorphism detection can meet clinical detection requirements.

Xinjiang Hui nationality;gene polymorphism;cytochrome P450 2C9;vitamin K epoxide reductase complex subunit 1

新疆維吾爾自治區烏魯木齊市衛生和計劃生育委員會科學技術計劃項目(201501)。

柴樹紅，女，副主任技師，主要從事分子生物學和個體化基因檢測研究。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.17.005

A

1673-4130(2016)17-2371-03

2016-04-05

2016-06-11)