精神分裂癥樣小鼠血液中miRNA-132的表達分析

張高麗，于海川

(1.河南省周口市中心血站　466000；2.新鄉醫學院醫學檢驗學院　453003)

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·論著·

精神分裂癥樣小鼠血液中miRNA-132的表達分析

張高麗1，于海川2

(1.河南省周口市中心血站466000；2.新鄉醫學院醫學檢驗學院453003)

目的使用地卓西平馬來酸鹽(MK-801)腹腔注射制備精神分裂癥小鼠模型，研究精神分裂癥小鼠外周血中miRNA-132的異常表達情況。方法選取成年雄性昆明小鼠，隨機分為注射生理鹽水組(對照組)和注射MK-801組(實驗組)，觀察小鼠的行為學改變，用實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)法檢測各小鼠血液中miRNA-132的表達情況。結果(1)實驗組小鼠刻板行為評分與對照組比較有顯著增高(P<0.05)，自發活動增加顯著，表現為直立數明顯減少而走格數明顯增多(P<0.05)，符合精神分裂癥模型小鼠的表現。(2)與對照組相比，實驗組miRNA-132表達下調，差異有統計學意義(P<0.05)。結論miRNA-132在精神分裂癥小鼠血液中有異常表達。

地卓西平馬來酸鹽;小鼠模型;精神分裂癥;miRNA-132

精神分裂癥是一組病因未明的、復雜的精神疾病，臨床表現為感知、思維、情感、行為等方面的障礙，精神活動與環境的不協調為主要特征的一類最常見的、反復發作的慢性遷延性疾病。近些年，盡管對精神分裂癥已經進行了大量的研究，但其準確的分子機制還未闡明。miRNA是一種非編碼的單鏈小分子RNA，長度為19～24個核苷酸，在轉錄后其通過抑制基因表達調節幾乎所有的生物過程[1]。研究表明，miRNA在轉錄后水平調控基因功能的失調，與神經精神障礙的起始和發生過程有著密切關系。本研究擬對昆明小鼠連續注射地卓西平馬來酸鹽(MK-801)制備精神分裂癥樣模型，觀察小鼠行為學的改變，研究精神分裂癥樣小鼠外周血中miRNA-132的異常表達，進而探討miRNA-132與精神分裂癥的相關性，為深入研究精神分裂癥的發病機制提供新的依據。

1　材料與方法

1.1實驗動物昆明小鼠，成年，雄性，體質量20～30 g，由新鄉醫學院實驗動物中心提供。于12 h晝夜節律下(8:00～20:00)籠養，保證動物飲水與進食自由，小鼠適應實驗環境1周后將其隨機分為注射生理鹽水組的對照組和注射MK-801的實驗組，每組各20只。

1.2方法將Sigma公司生產的MK-801溶于生理鹽水中，實驗組小鼠右后側腹腔注射0.6 mg/kg，對照組小鼠右后側腹腔注射等體積生理鹽水，均連續注射7 d。

1.2.1MK-801誘導昆明小鼠精神分裂癥模型的建立[2]實驗組和對照組均于末次注射后10 min，開場實驗評價小鼠自發活動能力和記錄小鼠刻板性動作。

1.2.2開場實驗參照文獻[2]，開場實驗箱(36 cm×36 cm×38 cm)，將底面劃成16塊相等的方格(9 cm×9 cm)，上方敞開。觀察時輕提鼠尾將動物放在敞箱中央，每次測試10 min，記錄小鼠自發活動能力(爬格數為觀察期內昆明小鼠四肢爬過的格子數)。

1.2.3刻板性動作MK-801作用于昆明小鼠，產生類似精神分裂癥的刻板性動作癥狀，如小鼠反復搖頭、轉圈、小范圍內不停的無規則運動等。采用5分級評分，每10 min評分1次，觀察2 h取其平均值。由3名不知情人員按評分表的要求進行盲法測評，以3名測評者評分的平均分納入統計。

1.2.4標本采集與制備摘除眼球，顛倒試管2～3次，使血液與抗凝劑充分混勻。快速收集小鼠新鮮血液2～4 mL，放入含有乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，混勻后用低溫冰箱2 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入1mL Trizol，室溫放置5 min后提取總RNA。

1.2.5總RNA和反轉錄總RNA提取試劑由本實驗室自配，按照總RNA快速提取步驟操作。miRNA反轉錄試劑盒(Takara公司,貨號RR047A)按照說明書進行反轉錄反應。

1.2.6實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測儀器為Thermo公司，按照Takara公司試劑盒(貨號DR037S)說明書操作。RT-PCR反應體系如下：cDNA 1.0 μL，ddH2O 3.6 μL，Primer 10.2 μL，Primer 20.2 μL，2×Mix 5.0 μL。反應條件：95 ℃ 5 min,95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,40個循環，每個反應重復3次。

2　結　　果

2.1兩組小鼠自發活動和刻板行為比較經MK-801誘導后的實驗組小鼠自發活動增加。末次給藥10 min后，與對照組比較，實驗組的昆明小鼠直立數明顯減少而走格數明顯增多，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1　　兩組小鼠自發活動和刻板行為比較±s)

注：與對照組給藥后比較，△P<0.05。

2.2實驗組誘導模型小鼠刻板行為的表現MK-801可使昆明小鼠的行為出現明顯異常。一般給藥10 min后開始出現行為異常，20～60 min最明顯，2 h后逐漸減弱。主要表現為反復搖頭、轉圈、小范圍內不停地無規則運動等刻板性動作，與對照組比較，實驗組刻板行為明顯增多(P<0.05)，見表1。

2.3兩組小鼠miRNA相對表達水平的比較與對照組相比，實驗組中miRNA-432、miRNA-132、miRNA-181b表達水平顯著下調，差異均有統計學意義(P<0.05)。miRNA-30a表達上調，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

注：與對照組比較，*P<0.05。

圖1實驗組與對照組miRNA的表達變化

3　討　　論

MK-801是一種高親和力的NMDA受體非競爭性拮抗劑，可以使模型小鼠模擬精神分裂癥的陽性癥狀和陰性癥狀，從而導致小鼠認知能力下降。同時也可改變腦部及血液中部分miRNA的表達。實驗結果表明，MK-801可以導致昆明小鼠產生類似精神分裂癥的癥狀，且精神分裂癥表現較明顯，實驗動物模型具有可重復性。

miRNA是在真核細胞中發現的，一類短的內源性非編碼單鏈RNA分子，能夠與特定mRNA靶點結合，調節蛋白質的翻譯過程，進而調控基因的表達。有研究預測，人約有60%的蛋白基因表達受到miRNA分子的調節[3]。miRNA廣泛存在于血漿和血清中，且在血漿和血清中非常穩定。由于小鼠腦組織標本不易獲得miRNA，而血液miRNA檢測相對簡單可行，且在血液和腦組織中的miRNA表達具有一定的一致性，因此血液miRNA相關的研究也獲得科學家的認可。本實驗結果顯示，與對照組相比，實驗組中miRNA-30a表達水平上調，miRNA-432、miRNA-132、miRNA-181b表達水平下調。表明這4種miRNA可能與精神分裂癥的發病機制存在相關性。miR-132是一種在神經和免疫方面起重要調節作用的miRNA[4]。Hansen等[5]的研究表明，CAMP反應元件結合蛋白可以調節miRNA-132，在成熟神經系統中miRNA-132的減少會導致突觸異常，從而帶來一系列與神經認知方面相關的疾病。Miller等[6]研究表明，精神分裂癥中miRNA-132與神經發育和成人腦功能有密切關系，通過對100 例患者的研究中，發現與健康對照者相比，精神分裂癥患者前額皮質層miRNA-132表達顯著下降。這一結果與本研究發現的實驗組血液中miRNA-132表達顯著降低的結果相互吻合，說明miRNA-132不管在腦組織中還是血液中都可能成為精神分裂癥生物標志物之一，具有很大的研究價值。

生物信息學技術的運用使得miRNA靶基因的預測有了很大進展。接下來本研究將收集偏執型精神分裂癥的臨床患者，進一步尋找及驗證miRNA-132精神分裂癥相關靶基因，并檢測這些靶基因的表達情況，這將有助于揭示miRNA-132在調控精神分裂癥發病和治療中的詳細分子機制，進而為深入研究精神分裂癥的發病機制提供新的思路，甚至為最終治療精神分裂癥找到新的突破方向。

[1]Ding XC,Weiler J,Grosshans H.Regulating the regulators:mechanisms controlling the maturation of microRNAs[J].Trends Biotechnol,2009,27(1):27-36.

[2]Kuzmin A,Madjid N,Terenius L,et al.Big dynorphin,a prodynorphin-derived peptide produces NMDA receptor-mediated effects on memory,anxiolytic-like and locomotor behavior in mice[J].Neuropsychopharmacology,2006,31(9):1928-1937.

[3]Bartel DP.MicroRNAs:target recognition and regulatory functions[J].Cell,2009,136(2):215-233.

[4]Wanet A,Tacheny A,Arnould T,et al.miR-212/132 expression and functions:within and beyond the neuronal compartment[J].Nucleic Acids Res,2012,40(11):4742-4753.

[5]Hansen KF,Karelina K,Sakamoto K,et al.miRNA-132:a dynamic regulator of cognitive capacity[J].Brain Struct Funct,2013,218(3):817-831.

[6]Miller BH,Zeier Z,Xi L,et al.MicroRNA-132 dysregulation in schizophrenia has implications for both neurodevelopment and adult brain function[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2012,109(8):3125-3130.

Analysis on blood miRNA-132 expression in schizophrenia mice

ZHANGGaoli1,YUHaichuan2

(1.ZhoukouBloodCenter,Zhoukou,Henan466000,China;2.SchoolofLaboratoryMedicine,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang,Henan453003,China)

ObjectiveTo prepare the schizophrenia mouse model by using peritoneal injection of dizocilpine maleate(MK-801),then to study the peripheral blood miRNA-132 abnormal expression in schizophrenia mouse model.MethodsAdult male Kunming mice(KM) were selected and randomly divided into the normal saline group(control group) and MK-801 group(experimental group).The behaviors changes were observed.Real-time PCR method was used to detect the miRNA-132 expression in peripheral blood.Results(1) Compared with the control group,the stereotyped behavior score in the experimental group was increased significantly(P<0.05),the spontaneous activity was increased significantly(P<0.05),showing that the up-right number was significantly decreased,while the walking-grid number was significantly increased(P<0.05),which was consistent with the manifestations of schizophrenia mouse model.(2)Compared with the control group,the miRNA-132 expressed in the experimental group was down-regulated,the difference was statistically significant(P<0.05).ConclusionmiRNA-132 is abnormally expressed in blood of schizophrenia mouse.

dizocilpine maleate;mouse model;schizophrenia;miRNA-132

張高麗，女，主管技師，主要從事生物化學與分子生物學研究。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.17.014

A

1673-4130(2016)17-2394-02

2016-03-07

2016-05-15)