廣州地區兒童空腸彎曲菌感染的檢測與分析

謝永強，鐘華敏，虢　艷，關小珊，龐舒尹

(廣東省廣州市婦女兒童醫療中心檢驗科　510120)

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·臨床研究·

廣州地區兒童空腸彎曲菌感染的檢測與分析

謝永強，鐘華敏，虢艷，關小珊，龐舒尹

(廣東省廣州市婦女兒童醫療中心檢驗科510120)

目的掌握廣州地區空腸彎曲菌引起兒童感染性腹瀉的現狀，探索空腸彎曲菌的檢測方法及耐藥狀況。方法對2011～2014年該院可疑空腸彎曲菌感染患兒的糞便進行病原菌的分離培養和常規生化鑒定，然后進行聚合酶鏈反應(PCR)測序確認，同時對所分離菌株進行藥敏試驗。結果近4年來從2 088例腹瀉患兒糞便標本中共檢出154株空腸彎曲菌，經生化反應鑒定和PCR檢測確認，PCR檢測限可達6 CFU/mL；該地區兒童感染空腸彎曲菌對亞胺培南和氨基糖苷類藥物敏感，對氯霉素、林可霉素和紅霉素等抗菌藥物耐藥率<10%,對氟喹諾酮、氨芐西林和四環素有較高耐藥率(24.03%～44.16%)，對復方磺胺甲噁唑和頭孢菌素耐藥。結論空腸彎曲菌是兒童腹瀉的重要病原菌之一，重癥患者可導致嚴重后果，應引起重視，積極開展對疑似患者的空腸彎曲菌檢測；常規檢測和特異性的PCR檢測有利于提高檢出率。

兒童；空腸彎曲菌；感染；抗菌藥物

空腸彎曲菌廣泛寄生于溫血動物的腸道，是當今全球范圍內廣受重視的人畜共患病原菌之一，可引起動物腹瀉、流產，可導致人類急性胃腸炎、格林巴利綜合征、反應性關節炎、Reiter′s綜合征等多種疾病。自上個世紀末以來，空腸彎曲菌逐漸上升成食源性感染的主要因素之一，但由于其培養生長條件苛刻、培養時間較長、對檢測人員的經驗水平要求較高，普通醫療機構實驗室并未普遍開展空腸彎曲菌的培養檢測[1]。為掌握廣州地區兒童感染空腸彎曲菌的現狀，給臨床防治感染提供實驗室依據，本研究對本院2010～2014年收治的腹瀉患兒糞便進行空腸彎曲菌的檢測分析，現報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料2010～2014年本院收治的腹瀉患兒糞便標本2 088例。

1.2儀器與試劑Cary-Blair運送培養基(杭州天和微生物試劑有限公司產品)，改良木炭-頭孢哌酮-去氧膽酸鹽瓊脂(CCDA)培養基，改良Campy-BAP彎曲菌培養基及藥敏紙片(均為英國Oxoid公司產品)，微需氧袋和API Campy生化鑒定試劑條(法國生物梅里埃公司產品)。

1.3標本采集將無菌棉簽用生理鹽水濕潤后，蘸取患兒糞便的黏液或膿血部分,置于Carry-Blair運送培養基中室溫保存送檢。

1.4病原菌分離培養實驗室收到待檢糞便標本后立即接種于改良CCDA培養基,置微需氧條件(氧氣5%、二氧化碳10%、氮氣85%)42 ℃培養48 h,挑取灰色或紫紅色、有光澤、并從接種線向外有擴散傾向的菌落或邊緣完整、微凸、發亮的水滴樣可疑菌落進行革蘭染色鏡檢,若染色為革蘭陰性,呈S形、螺旋狀或紡錘形則初步認為符合空腸彎曲菌特征，再接種到改良CCDA培養基或哥倫比亞血瓊脂進行純培養,繼續42 ℃微需氧培養24～48 h。

1.5病原菌鑒定

1.5.1病原菌的常規生化鑒定將疑似空腸彎曲菌的純培養物進行氧化酶、過氧化氫酶(觸酶)、馬尿酸鹽利用和硝酸鹽還原試驗,如為陽性可初步鑒定為彎曲菌。將初步鑒定為彎曲菌的純培養物制成6麥氏單位的菌液,按要求接種到API Campy生化鑒定試劑條上,孵育24 h后按操作說明判讀結果。

1.5.2聚合酶鏈反應(PCR)鑒定(1)模板提取。用滅菌雙蒸水制備待檢菌懸液(0.5麥氏單位)，置于沸水中加熱10 min，然后12 000 r/min 離心15 min，取上清液分裝于Eppendorf管作為擴增反應的DNA模板。(2)PCR引物。查閱相關網站關于空腸彎曲菌的VSI基因序列保守片段，用Premier5.0軟件設計一對特異引物，F：5′-TACGATTTGTTTCATTG-3′；R：5′-ATTTCTTTAGCAGGCATA-3′。(3)反應體系。包括PCR Buffer 2.5 μL、Taq酶1.25 μL、200 μmol/L dNTP 2.5 μL、引物各10 μmol/L、模板2.5 μL。(4)PCR循環參數。95 ℃預變性5 min，94 ℃ 1 min→55 ℃退火1 min→72 ℃延伸1 min，共30個循環；最后延伸10 min。(5)PCR產物分析。取擴增產物10 μL在1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳，然后分析其遷移率，與質控菌株ATCC29482進行比對。(6)PCR檢測的敏感性分析。將0.5麥氏單位PCR分析用菌液作1∶10的依次稀釋進行上述PCR檢測，直至不能檢測出來。

1.6病原菌藥敏試驗采用美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)推薦使用的瓊脂紙片擴散(Kirby-Bauer)法。將被檢菌制成0.5麥氏單位的菌懸液，均勻涂抹在厚度為4 mm的Campy-BAP培養基上，42 ℃平衡10～15 min，貼抗菌藥物紙片，置微需氧袋42 ℃孵育48 h后按照CLSI標準判讀結果，抑菌環的邊緣以肉眼觀察不到細菌明顯生長為限。

2　結　　果

2.1病原菌檢出率對本院2011～2014年收治的感染性腹瀉患兒2 088例糞便標本進行空腸彎曲菌的分離培養，經API Campy生化鑒定系統分析，共檢出空腸彎曲菌154株，檢出率為7.38%。其年齡構成見表1。

表1　　廣州地區兒童空腸彎曲菌感染情況

2.2PCR鑒定結果對分離到的154株菌株進行PCR鑒定，對特異性擴增片段進行遷移率計算，大小為516 bp，與質控菌株一致，同源性達99.5%。

2.3PCR方法的敏感性10-5倍菌液還能擴增出特異性片段，而10-6倍菌液則不能擴增特異性片段，菌液平板記數得出10-5倍菌液含菌體6 CFU/mL，故該PCR方法的檢測敏感度為6 CFU/mL。

表2　　154株空腸彎曲菌對常用抗菌藥物的藥敏結果[n(%)]

續表2　　154株空腸彎曲菌對常用抗菌藥物的藥敏結果[n(%)]

2.4藥敏試驗結果154株空腸彎曲菌對抗菌藥物的藥敏試驗表明,空腸彎曲菌對碳青霉烯類、氨基糖苷類和酶抑制劑敏感，對氯霉素、林可霉素和紅霉素等抗菌藥物耐藥率<10%,對氨芐西林、喹諾酮類和四環素有較強耐藥性(耐藥率為24.03%～44.16%)，對磺胺類和頭孢菌素耐藥，見表2。

3　討　　論

空腸彎曲菌是引起兒童散發性感染性腹瀉的常見病原之一，常有水樣便，一日可達10～20次，時間遷延可轉為黏液膿血便。彎曲菌感染可發生于各個年齡段，在發達國家，易感者多為大齡兒童和青年[2]。近年來本院空腸彎曲菌腸炎患者以嬰幼兒多見，占發病總數的50%，與國內其他地區報道的患者年齡分布特點類似[3]。彎曲菌腸炎全年均可發病，以夏秋季為主，不同地區之間感染高峰季節可能存在差異。本院腸道門診收治的空腸彎曲菌腸炎發病高峰集中在6～8月，與許海燕等[4]報道揚州市區腹瀉人群中空腸彎曲菌感染流行情況基本相似。

空腸彎曲菌感染病程常呈自限性，輕癥患者不需要抗菌藥物或其他特殊治療，但對癥狀較重、病情遷延者需要使用敏感抗菌藥物治療。藥敏試驗結果顯示碳青霉烯類、酶抑制劑、大環內酯類和氨基糖苷類藥物對彎曲菌有很好的抑菌活性，氟喹諾酮類抗菌藥物的耐藥性有逐年增加趨勢[5]，頭孢菌素和磺胺類對其抑菌活性差。因此，空腸彎曲菌腸炎的抗菌治療宜優先考慮胃腸道吸收較好的敏感抗菌藥物，如紅霉素等。

近年來PCR及其相關技術應用于空腸彎曲菌的鑒定、診斷取得了顯著進展，特別是不斷涌現的分子診斷技術用于各類標本空腸彎曲菌的直接檢測和分型等研究，有利于對空腸彎曲菌感染或作為食源性監測的快速、準確病原學診斷。PCR檢測技術能簡便、快速地擴增目的基因，從微量水平甚至痕量水平檢測，敏感性和特異性很好，可以做到定量和多重檢測，但實際應用中一個最大缺點是容易出現假陽性[6-7]。特異性PCR檢測結合傳統的生化鑒定方法，能夠相互驗證，可以提高檢出率和準確性，但因為需要特殊的設備和較高的操作水平等多種因素制約其在基層醫院推廣應用。

[1]聶青和．感染性腹瀉的研究現狀[J]．傳染病信息，2007，20(4)：193-196．

[2]Moolhuijzen PM,Lew-Tabor AE,Wlodek BM,et al.Genomic analysis of Campylobacter fetus subspecies:identification of candidate virulence determinants and diagnostic assay tarfets[J].BMC Microbiol,2009,75(9):86-89.

[3]林玫，周凌云，王鳴柳，等．廣西空腸彎曲菌和結腸彎曲菌流行病學調查[J]．中國人獸共患病學報，2012，28(11)：1143-1147．

[4]許海燕，黃金林，包廣宇，等．揚州市區腹瀉人群空腸彎曲菌和結腸彎曲菌流行狀況及耐藥性分析[J]．中國人獸共患病學報，2008，24(1)：58-62．

[5]謝永強，周珍文，虢艷，等．廣州地區兒童空腸彎曲菌感染的病原學研究[J]．中國當代兒科雜志，2009，11(6)：422-424．

[6]Allos BM.Campylobacterjejuni infections:update on emerging issuse and trands[J].Clin Infect Dis,2001,32(8):1201-1206.

[7]陳鳳華，孫建華，馬盈盈，等．實時熒光定量PCR技術在病原體快檢中的研究進展與應用[J/CD]．中華臨床醫師雜志(電子版)，2013，7(23)：11004-11006．

廣東省科技廳社會發展領域科技計劃項目(粵科社字2011-106)；廣東省廣州市衛生局科研立項(201102A213044)。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.17.037

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1673-4130(2016)17-2448-03

2016-03-03

2016-05-11)