玉米(zea mays.L)ZmCen基因原核表達載體的構建及表達體系的優(yōu)化

雷海英，白鳳麟，王志軍

（1.長治學院生物科學與技術系，山西長治046011；2.長治學院化學系，山西長治046011）

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玉米(zea mays.L)ZmCen基因原核表達載體的構建及表達體系的優(yōu)化

雷海英1，白鳳麟1，王志軍2

（1.長治學院生物科學與技術系，山西長治046011；2.長治學院化學系，山西長治046011）

以玉米(zea mays L.)cDNA為模板，并將其構建到帶有GST表達標簽的原核表達載體pGEX-6p-1中，構建的重組載體pGEX-6p-Zmcen轉化至大腸桿菌BL21（DE3）。為表達出較大量的可溶性GST-ZmCen融合蛋白，設置0.1 mmol/L,0.3 mmol/L和0.5 mmol/L IPTG3種不同濃度，誘導溫度和4 h、16 h和20 h的誘導時間建立正交體系，誘導產(chǎn)物經(jīng)超聲波裂解破碎細胞后，通過12%SDS-PAGE比較分析融合蛋白表達量，從而確定最佳的表達體系。結果顯示：當誘導溫度28℃，IPTG濃度為0.3 mmol/L，誘導20 h時可以獲得較大量的45kD可溶性融合蛋白（GST-ZmCen）表達量。

玉米；中心蛋白；原核表達；體系優(yōu)化

1　引言

作為真核細胞胞質(zhì)骨架的主要成分之一，微管組織中心（Microtubule-organizing centre，MTOC）不僅為微管提供了生長的起點，而且還決定了微管的方向性。其復制的改變會導致細胞分裂中止或癌癥的產(chǎn)生[1,2,3]。微管組織具有多種功能，如纖毛和鞭毛的運動、細胞運動和胞質(zhì)流動、染色體運動、細胞形態(tài)的維持、細胞內(nèi)外的運輸、細胞表面受體的固定等[4]。存在于細胞內(nèi)的中心粒是主要的微管組織中心，但真正起微管組織作用的不是中心粒本身，而是中心粒周圍的蛋白或與之相當?shù)奈镔|(zhì)。高等植物由于沒有特殊結構的MTOC，只能靠其他一些含微管相關蛋白的細胞器來行使類似的功能。中心蛋白是作為MTOC或中心粒周圍的蛋白保守成分之一。已有研究表明，中心蛋白具有保守的EF-hand鈣結合蛋白，分子量約20 kD的酸性蛋白，屬于鈣調(diào)蛋白超家族中的一員，也是負責MTOC細胞復制和分裂所必需的蛋白之一[5,6]。中心蛋白最早是從綠藻[7]中鑒定得到的，目前很多研究主要集中在哺乳動物、低等植物等，對高等植物的中心蛋白研究較少，迄今為止克隆到的中心蛋白基因主要有鹽沼植物濱藻Atriptex thaliana的AtCen[8]，擬南芥Arabidops thaliana的AtCen[9]，煙草Nicotiana tabacum的兩個同源基因NtCenl和NtCen2[10]，水蕨Marsilea vestita 的MvCen[11]等，它們內(nèi)部約有77%-78%的同源性。中心蛋白在細胞有絲分裂、紡錘體的分離、纖維的收縮等過程中起重要作用[12]。

文章克隆了玉米中心蛋白Zmcen基因，為能誘導表達出較大量的可溶性中心蛋白，對表達體系進行了優(yōu)化，為后續(xù)的相關性質(zhì)研究奠定了基礎。

2　實驗方法

2.1材料與試劑

試驗所用玉米自交系材料鄭58，種子由山西省農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究中心提供，在本實驗室花盆種植一周后，取其新鮮葉片提取總RNA。本研究中Trizol總RNA抽提試劑盒、Taq DNA聚合酶、IPTG、DNA Marker、瓊脂糖、RT-PCR試劑盒、限制性內(nèi)切酶BamH I、Sal I、T4 DNA連接酶均購Takara公司產(chǎn)品；原核表達載體pGEX-6p-1由山西大學分子研究所楊斌盛教授實驗室惠贈；凝膠回收試劑盒、小量制備質(zhì)粒DNA試劑盒為Omega公司產(chǎn)品；大腸桿菌BL21(DE3)為本實驗室保存；PCR引物合成、樣品測序均由上海生工生物工程有限公司完成。

2.2實驗方法

2.2.1總RNA提取

取玉米一周的幼苗0.1～0.2 g，液氮中研磨成粉末，提取總RNA，提取方法參照TaKaRa公司Trizol 總RNA抽提試劑盒說明書，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的質(zhì)量，微量紫外分光光度計（Nano2000，America）定量RNA樣品。

2.2.2RT-PCR法

參照RT-PCR試劑盒說明書，去除基因組DNA后，將總RNA反轉錄成cDNA，反應體系為37℃15 min；85℃5 s；后置于4℃保存。

2.2.3重組載體的構建

以Zmcen基因的cDNA作為模板，使用Primer5.0軟件設計PCR擴增引物：上游引物為mL：5′-GCC GGATCC ATGAGTTTCAACCAGT-3，下游引物為mR：5′-GCC GTCGACTCAAGCACTC ACAGA-3′。(畫線部分分別為BamH I、Sal I限制性內(nèi)切酶酶切位點，下游引物中TCA為終止密碼子)。PCR反應體系為20 μL，PCR反應程序：94℃預變性5 min，94℃35 s，55℃40 s，72℃3 min，72℃7 min，30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳檢測擴增片段。

將回收純化后的PCR產(chǎn)物和表達載體pGEX-6p-1分別用Bam H I、Sal I雙酶切，純化試劑盒回收PCR擴增產(chǎn)物，1%瓊脂糖電泳回收線性載體。目的DNA片段與雙酶切后的線性pGEX-6p-1載體連接，構建pGEX-6p-Zmcen重組載體，轉化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞，涂布于含有氨芐青霉素（50 μg/mL）的固體LB培養(yǎng)基上于37℃培養(yǎng)過夜，挑取單克隆進行菌落PCR擴增，同時保存?zhèn)浞菥骸＝?jīng)菌液PCR初步鑒定正確后，送由上海生工生物工程有限公司進一步測序鑒定。

2.2.4表達條件優(yōu)化

取已構建轉化好的原核表達菌株pGEX-6p-Zmcen-BL21單菌落接到10 mL含氨芐青霉素（50μg/mL）的LB培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)過夜。次日，將過夜培養(yǎng)菌液按1︰100的比例接入含50μg/mL氨芐的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)2-3h，當菌液濃度至OD600=0.6-0.8時，分別對IPTG濃度、誘導溫度及誘導時間三種條件設置三因素三水平正交實驗，IPTG終濃度分別設定為0.1mmol/L，0.3 mmol/L，0.5mmol/L，誘導溫度設定為20℃，28℃，37℃，誘導時間分別為4 h，16 h，20 h時留取樣品，同時留取空載體和不誘導樣品作為對照組，離心收集菌體，沉淀菌體用PBS緩沖液（140 mmmol/L NaCl，2.7 mmmol/L KCl，10 mmmol/L Na2HPO4，1.8 mmmol/L KH2PO4，pH7.4）清洗1次，5000 rpm/min離心10 min，沉淀加500 μL PBS緩沖液，超聲波破碎細胞，頻率為20KHz，超聲處理3-5 s，間隙3-5 s。持續(xù)10-15min后，離心，取上清4℃儲存?zhèn)溆?。蛋白樣品中加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，混勻，100℃煮沸5min，12%SDS-PAGE電泳檢測。通過分析蛋白表達量確定最佳表達體系。

表1　BL21重組菌正交實驗設計L9(33）Tab.1 BL21 Recombinant bacteria orthogonal experiment program L9(33）

3　結果與討論

3.1玉米ZmCen cDNA序列擴增

經(jīng)RT-PCR擴增后，擴增產(chǎn)物由1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖1A所示，擴增片段特異性強，無雜帶，帶有酶切位點和保護堿基序列的ZmCen的目的條帶大小為534 bp，其CDS序列與預期的序列大小相符，初步確定這些擴增片段為目的片段，回收目的片段用于重組載體的連接。

3.2ZmCen cDNA重組載體的構建

將構建的重組載體pGEX-6p-Zmcen轉化大腸桿菌BL21（DE3），篩選克隆提取質(zhì)粒雙酶切鑒定，菌落PCR擴增產(chǎn)物，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，有目的條帶的陽性克隆送至上海生工測序鑒定（圖1A/1B），陽性克隆測序結果如圖2所示，測序結果包含有完整的ORF，且沒有突變和移碼，與NCBI報道的玉米基因Zea mays caltractin（LOC100284444）mRNA的cDNA序列一致，其CDS長為516bp，編碼172個氨基酸證明已成功克隆出了Zmcen cDNA。經(jīng)測序公司鑒定后命名為pGEX-6p-Zmcen-BL21，用于后續(xù)蛋白表達。

圖1　玉米ZmCen擴增（A）與重組載體鑒定（B）的電泳結果圖A：DL1000 DNA Marker與PCR擴增產(chǎn)物；B：M1與M2分別為DL1000、λHind III DNA Marker，1與2分別為重組載體pGEX-6p-ZmCen的質(zhì)粒與酶切產(chǎn)物Fig.1 PCR amplification of ZmCen gene(A)and the recombinant plasmid digested by restriction endonuclease of pGEX-6p-AtCen2(B),A:M,DL1000 DNA Marker;1,The product of PCR amplification.B:M1 and M2 were DL1000 and λHind III DNA Markers.1,The recombinant plasmid;2,The product of the recombinant plasmid pGEX-6p-ZmCen digested.

圖2　ZmCen cDNA克隆測序結果及氨基酸序列Fig2ThecDNAandanomyacidsequencesofZmCengene

3.3中心蛋白的原核誘導表達

由于在預實驗中重組pGEX-6p-Zmcen-BL21菌株在通常的表達體系中難以表達出較大量的可溶性蛋白，經(jīng)過體系的調(diào)整也只能有少量的可溶性蛋白出現(xiàn)，而大量的蛋白只以包涵體的形式出現(xiàn)，不利用后續(xù)蛋白分離純化的利用。因此，為使重組菌株pGEX-6p-Zmcen-BL21的目的基因Zmcen能大量在上清中表達出可溶性的蛋白，通過設置正交實驗，對3種不同溫度、3種IPTG濃度及3個不同的誘導時間，進行融合蛋白GST-ZmCen誘導表達。不同誘導體系的超聲破碎產(chǎn)物經(jīng)12% SDS-PAGE電泳分析，從而確定能夠表達出較大量可溶性蛋白的最佳體系，其代表性的電泳結果如圖3所示。

圖3　玉米ZmCen不同誘導條件下的12%SDS-PAGE電泳結果M：蛋白質(zhì)Marker；A和B：1、2分別表示對照組pGEX-6p-1的未誘導與誘導的產(chǎn)物；3、5、7泳道為超聲裂解細胞上清液，4、6、8泳道為超聲裂解細胞上清液，箭頭所指為誘導的重組菌pGEX-6p-ZmCen目的蛋白表達產(chǎn)物，其中僅在圖A的7泳道中的上清中表達出45 kD可溶性的融合目的蛋白；C為0.3mmol/L IPTG誘導的不同體系上清中蛋白表達；D為誘導20 h的不同體系上清中蛋白表達Fig.3 The result of ZmCen protein expression on12%SDS-PAGEM was marker of protein standard molecular weight；A and B:1 and 2 were the expression of negative control,3,5 and 7 lanes were the expression of ZmCen protein in supernatant with IPTG induction.4,6 and 8 lanes were the expression of ZmCen protein in deposition with IPTG induction.The induced solvable GST fusion protein of 45 kD was only expression in lane 7 of Fig A;C: the expression protein under 0.3mmol/L IPTG induction condition;D:the expression protein under induction 20 h condition。

從圖3中可以看出，圖3A中的部分體系在泳道4的沉淀中出現(xiàn)了大量的目的蛋白，第7泳道中有較大量的目的蛋白表達，同時沉淀中的蛋白較少（第8泳道）。圖3B不同體系的結果顯示，在第4、第8泳道中表達出了目的蛋白，但也都是沉淀中的表達，基本都是以包涵體的形式存在，上清中僅有少量的或微量的可溶性蛋白表達，結果也不利用蛋白的進一步純化。圖3C為0.3mmol/L IPTG的誘導條件的電泳結果，從圖可以看出，IPTG濃度相同條件下，誘導溫度和誘導時間的不同，誘導的目的蛋白的表達量也不同，其中第7、8、10泳道的表達量較大。圖3D為誘導時間在20 h條件下的蛋白表達結果，其中第7、9、10泳道的表達量較大。綜合正交表達條件下的所有誘導結果分析，當IPTG濃度為0.3mmol/L，28℃時誘導20h時，確定為GST-ZmCen融合蛋白表達的最佳體系，其表達的目的蛋白位于沉淀中的目的蛋白極少，大部分是存在于上清中的可溶性蛋白，而其他條件下有的未表達出可溶性的目的蛋白，即要么以包涵體的形式，要么表達量不夠。因此將此條件確定為誘導表達ZmCen的最適誘導條件。大量可溶性蛋白的成功誘導將為進一步用于的蛋白純化及性質(zhì)研究。

4　結論

構建的重組菌株pGEX-6p Zmcen-BL21，當誘導條件為0.3 mmol/L IPTG，溫度為28℃，誘導20 h時，位于上清中的GST-ZmCen可溶性融合蛋白大量被誘導表達，被確定為最佳的誘導條件。這將為后續(xù)蛋白的分離純化及性質(zhì)研究提供一定的借鑒。

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（責任編輯鐵軍）

Lei Hai-ying1,Bai Feng-ling1,Wang Zhi-jun2
（1.Department of Biology Science&Technology,Changzhi University,Changzhi,Shanxi 046011; 2.Department of Chemistry,Changzhi University,Changzhi Shanxi 046011）

Q753

A

1673-2014（2016）02-0005-05

國家自然科學基金項目（21201024）；山西省自然科學基金項目（2012021009-1）；山西省科技攻關項目（20140311005-3）。

2016—01—13

雷海英（1978－)，女，山西平遙人，講師，碩士，主要從事分子生物學教學與研究。