從生長分化因子-5調(diào)控關節(jié)軟骨形成觀察加味當歸四逆湯防治膝骨關節(jié)炎臨床研究

韋國雨　陳清雄　唐永亮　李鈺威

（1廣西桂平市中醫(yī)醫(yī)院骨科　桂平537200；2廣東省廣州宏宇生物技術有限公司　廣州510003）

從生長分化因子-5調(diào)控關節(jié)軟骨形成觀察加味當歸四逆湯防治膝骨關節(jié)炎臨床研究

韋國雨1陳清雄1唐永亮1李鈺威2

（1廣西桂平市中醫(yī)醫(yī)院骨科桂平537200；2廣東省廣州宏宇生物技術有限公司廣州510003）

目的：通過觀察治療前后膝骨關節(jié)炎患者生長分化因子-5（GDF-5）、血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF）及臨床癥狀計分變化，探討加味當歸四逆湯防治膝骨關節(jié)炎（KOA）的可能機制及臨床效用。方法：采用隨機、對照設計，選擇符合診斷標準、納入標準及排除標準的KOA患者62例，按就診順序1︰1隨機分為兩組，每組31例。治療組予加味當歸四逆湯，對照組予仙靈骨葆膠囊，連續(xù)4周。詳細記錄治療前、治療后2周及4周臨床癥狀計分變化，應用Real-time PCR技術檢測治療前后GDF-5及VEGF表達變化。結果：治療組臨床治愈10例，顯效7例，有效12例，無效2例，總有效率為93.55%；對照組臨床治愈6例，顯效5例，有效8例，無效12例，總有效率為61.29%，治療組總有效率明顯高于對照組，P＜0.05。治療前，兩組患者臨床癥狀計分對比，無顯著性差異。治療后2、4周，治療組臨床癥狀計分明顯低于對照組，P＜0.05。治療后，治療組在治療后2周關節(jié)疼痛明顯緩解，晨僵改善，關節(jié)功能部分恢復，治療后4周，關節(jié)疼痛顯著緩解，晨僵及關節(jié)活動消失。治療前，兩組患者GDF-5、VEGF表達對比無顯著性差異；治療后，兩組患者GDF-5、VEGF表達上升，且治療組上升更顯著（P＜0.05）。結論：加味當歸四逆湯可能通過上調(diào)GDF-5及VEGF表達，發(fā)揮緩解KOA的效用，值得推廣應用。

膝骨關節(jié)炎；生長分化因子-5，血管內(nèi)皮細胞生長因子；當歸四逆湯

膝骨關節(jié)炎（Knee Osteoarthritis，KOA）是臨床最為常見的退行性關節(jié)性疾病，發(fā)病年齡以中、老年人居多，故又稱為老年性骨關節(jié)病。其形成與年齡、外傷、肥胖、遺傳及活動過度有關，具體發(fā)病機制尚未明確，因此亦缺乏特效的治療手段［1～2］。中醫(yī)學將本病歸屬于“骨痹”范疇，其病機以“肝腎虧虛為本，寒濕瘀阻為標”，誠如《內(nèi)經(jīng)》云“痹之安生？其寒氣勝者為痛痹，濕氣盛者為著痹。”筆者在中醫(yī)藥理論指導下，應用當歸四逆湯隨證加減治療KOA，臨床療效顯著，但關于該方的具體機制尚未明確。現(xiàn)代醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)，KOA患者其發(fā)病機制雖然不明，但軟骨發(fā)育異常、損傷及進行性消失，細胞外基質(zhì)釋放增加，骨質(zhì)增生等被認為在KOA形成中占據(jù)重要地位［3～4］。生長分化因子-5（Growth Differentiation Factor-5，GDF-5）有廣泛地促進細胞分化的作用，能促使骨折的修復、軟骨的生成、修復韌帶組織，誘導脂肪細胞來源的間質(zhì)干細胞分化成骨、軟骨和肌腱等組織，尤其是GDF-5介導血管內(nèi)皮細胞生長因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）在KOA發(fā)生、發(fā)展中占據(jù)重要地位［5～6］。本研究應用隨機、對照研究設計，檢測治療前后患者GDF-5、VEGF表達變化，探討當歸四逆湯防治KOA的臨床療效及其可能機制。現(xiàn)報告如下：

1　臨床資料

1.1病例來源62例KOA病例均源自于2015年1～12月在桂平市中醫(yī)醫(yī)院骨科門診就診患者，其中男22例，女40例；平均年齡（56.27±12.46）歲；病程為（2.31±0.65）年。

1.2診斷標準西醫(yī)診斷標準參照《骨關節(jié)炎診治指南（2007年版）》［7］，中醫(yī)診斷標準參照《膝骨關節(jié)炎中醫(yī)診療專家共識意見（2015）》中關于“寒濕痹阻”證型［8］。

1.3納入標準（1）符合診斷標準；（2）年齡40～70歲；（3）能理解和簽署知情同意書者。

1.4排除標準 （1）膝關節(jié)間隙顯著狹窄或關節(jié)間形成骨橋連接而成骨性強直者；（2）本身具有關節(jié)炎癥表現(xiàn)的疾病，如類風濕性關節(jié)炎、強直性脊柱炎、痛風；并發(fā)癥影響到關節(jié)者，如炎癥性腸病、代謝性骨病等；（3）合并有骨腫瘤、骨結核或有明顯急性外傷史而造成半月板損傷、韌帶斷裂及血管神經(jīng)損傷以及有明顯膝關節(jié)內(nèi)外翻畸形史患者。

2　研究方法

2.1研究設計本研究采用隨機、對照設計，選擇符合診斷標準、納入標準及排除標準的KOA患者62例，按就診順序1︰1隨機分為兩組，每組31例。其中隨機數(shù)字表由簡明統(tǒng)計軟件形成，用不透光信封法實現(xiàn)隨機隱藏。

2.2分組給藥治療組：當歸四逆湯加減（當歸12 g、桂枝12 g、白芍12 g、細辛3 g、通草6 g、大棗8 g、炙甘草6 g、牛膝12 g、杜仲12 g），采用免煎中藥，每日1劑，分2次服，連續(xù)4周，由江蘇江陰天江藥業(yè)生產(chǎn)，購自本院藥房。對照組：仙靈骨葆膠囊（國藥準字Z20025337），每次3粒，3次/d，連續(xù)4周。

2.3觀察指標

2.3.1治療前后臨床癥狀計分變化臨床癥狀以關節(jié)疼痛、晨僵及關節(jié)屈伸不利為主要計分項。其中主要癥狀以關節(jié)疼痛為主：0分：無疼痛；2分：疼痛＜1 h，未影響到關節(jié)功能；4分：疼痛明顯，每天發(fā)作＞2 h，已影響到關節(jié)功能；6分：劇痛，難以行走。晨僵：0分：無；1分：晨僵＜1 h；2分：晨僵＞2 h，活動后可減輕；3分：晨僵明顯，活動無法減輕。關節(jié)屈伸不利：0分：無；1分：關節(jié)活動輕度受限，活動后可減輕；2分：關節(jié)活動明顯受限；3分：關節(jié)活動嚴重受限，影響生活。詳細記錄治療前及治療后2、4周癥狀計分變化。

2.3.2治療前后 GDF-5、VEGF表達變化應用Real-time PCR技術檢測治療前后KOA患者血清GDF-5、VEGF表達變化，具體步驟嚴格按照說明進行，委托廣州藍吉生物技術有限公司完成。見表1。

表1　人GDF-5、VEGF及GAPDH引物序列

2.4療效判定標準參照《國際骨關節(jié)炎研究學會髖與膝骨關節(jié)炎治療指南》［9］，采用主要癥狀療效判定法，即根據(jù)患者膝關節(jié)疼痛緩解情況設臨床治愈（疼痛基本消失）、顯效（疼痛明顯改善，即治療前后疼痛積分下降2個維度）、有效（疼痛有所改善，即治療前后疼痛積分下降1個維度）及無效（疼痛無明顯改善）。

2.5統(tǒng)計學分析采用SPSS18.0軟件分析處理數(shù)據(jù)。計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，符合正態(tài)分布，應用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3　結果

3.1兩組患者總體療效比較治療組臨床治愈10例，顯效7例，有效12例，無效2例，總有效率為93.55%；對照組臨床治愈6例，顯效5例，有效8例，無效12例，總有效率為61.29%，經(jīng)RIDIT分析，R=4.765，P＜0.05，治療組總有效率明顯高于對照組。

3.2兩組患者治療前后臨床癥狀計分變化比較治療前，兩組患者臨床癥狀計分對比，無顯著性差異。治療后2、4周，治療組臨床癥狀計分明顯低于對照組，P＜0.05。治療后，治療組在治療后2周關節(jié)疼痛明顯緩解，晨僵改善，關節(jié)功能部分恢復；治療后4周，關節(jié)疼痛顯著緩解，晨僵及關節(jié)活動消失。見表2。

表2　兩組患者治療前后臨床癥狀計分變化比較（分，x±s）

3.3兩組患者治療前后GDF-5、VEGF表達變化比較治療前，兩組患者GDF-5、VEGF表達對比無顯著性差異；治療后，兩組患者GDF-5、VEGF表達上升，且治療組上升更顯著（P＜0.05）。見表3。

表3　兩組患者治療前后GDF-5、VEGF表達變化比較

表3　兩組患者治療前后GDF-5、VEGF表達變化比較

注：與治療前比較，*P＜0.05；與對照組比較，#P＜0.05。

組別　n　時間　GDF-5　VEGF治療組對照組31 31治療前治療后治療前治療后0.78±0.09 1.69±0.05*#0.84±0.06 1.03±0.11 0.73±0.12 1.82±0.07*#0.76±0.08 1.12±0.10

4　討論

KOA作為危害中老年人生活質(zhì)量發(fā)病率最高的骨關節(jié)疾病，日益受到學界重視，現(xiàn)階段對于KOA治療仍然是以緩解癥狀和改善關節(jié)功能為主。中醫(yī)學認為本病屬于骨痹范疇，《素問·痹論》骨痹者，多源于氣血不足，寒濕之邪傷于骨髓，誠所謂“病在骨，骨重不可舉，骨髓酸痛，寒氣至，名曰骨痹。”筆者在中醫(yī)學指導下，依據(jù)多年臨床經(jīng)驗發(fā)現(xiàn)骨痹平時以氣血不足、肝腎虧虛為主，發(fā)時往往以寒濕浸淫多見，應用當歸四逆湯加減治療KOA，療效明顯。本研究結果亦發(fā)現(xiàn)治療組療效明顯優(yōu)于對照組，加味當歸四逆湯具有緩解關節(jié)疼痛、屈伸不利的效用。該方以當歸甘溫，養(yǎng)血和血；桂枝辛溫，溫經(jīng)散寒，溫通血脈，為君藥。細辛溫經(jīng)散寒，助桂枝溫通血脈；白芍養(yǎng)血和營，助當歸補益營血，共為臣藥。通草通經(jīng)脈，以暢血行；大棗、甘草，益氣健脾養(yǎng)血，共為佐藥。重用大棗，既合歸、芍以補營血，又防桂枝、細辛燥烈大過，傷及陰血。甘草兼調(diào)藥性而為使藥。佐以牛膝、杜仲補腎壯骨，引經(jīng)下行，全方溫陽與散寒并用，養(yǎng)血與通脈兼施，溫而不燥，補而不滯，共奏溫經(jīng)散寒、養(yǎng)血通脈之效。

GDF-5， 又 稱 骨 形 態(tài) 發(fā) 生 蛋 白（Bone Morphogenetic Protein，BMP）14或軟骨衍生蛋白1，作為胚胎發(fā)育、細胞分化、機體軟骨形成、骨骼發(fā)育等的重要調(diào)節(jié)因子而倍受重視［10～11］。GDF-5隸屬轉化生長因子 β（Transforming Growth Factor-β，TGF-β）家族，TGF-β家族是一類具有保守結構的二聚體蛋白，含近30個分泌信號分子，已發(fā)現(xiàn)9個亞族，另有BMP-2亞族、BMP-5亞族、Vg1亞族、BMP-3亞族、中間成員、活性素亞族、TGF-β亞族和“遠房”成員等，共27類因子［12］。GDF-5表達主要集中在胚胎軟骨間充質(zhì)細胞聚集區(qū)、長骨發(fā)育的軟骨核以及即將形成關節(jié)的區(qū)域。在軟骨發(fā)育初期，GDF-5分泌于肢體骨間質(zhì)區(qū)從而募集軟骨前體細胞并促進其分化，之后GDF-5在即將形成關節(jié)的區(qū)域表達［13～14］。研究發(fā)現(xiàn)，GDF-5在脂肪間充質(zhì)干細胞分化為骨細胞的實驗中，可能通過顯著地上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子的基因表達，而刺激骨的形成，提示GDF-5上調(diào)VEGF在骨再生方面的作用是肯定的［15～16］。本研究結果發(fā)現(xiàn)，治療前KOA患者血清GDF-5及VEGF表達下降，治療后KOA患者血清GDF-5及VEGF表達上升，該變化與KOA患者癥狀改善其同。

綜上所述，加味當歸四逆湯可能通過上調(diào)GDF-5及VEGF表達，發(fā)揮緩解KOA的效用。

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Clinical Study on Modified Dangguisini Decoction Treated with KOA on Regulating Articular Cartilage Formation by Growth Differentiation Factor-5

WEI Guo-yu1，CHEN Qing-xiong1，TANG Yong-liang1，LI Yu-wei2
（1The TCM Hospital in Guiping City，Guiping5372002；2Hongyu Biological Company of Guangzhou，Guangzhou510003）

Objective:The mechanism and clinical effect of modified Dangguisini decoction treated with knee osteoarthritis was investigated by observing the expression of GDF-5，VEGF and clinical symptom scoring changes.Methods:It was a randomized controlled trial.62 Cases of KOA who conformed to the diagnostic criteria，inclusion criteria and exclusion criteria，and randomly divided into two groups according to 1:1 based on treatment sequence.The intervention group was administrated with modified Dangguisini decoction，and control group was gave Xianlinggubao capsule.The clinical symptom scoring changes in detail were recorded before and after treatment for 2 weeks and 4 weeks.The expression of GDF-5 and VEGF were detected by Real-time PCR before and after the treatment.Results:The total curative effect in intervention group:10 cases were cured，7 cases had marked effect，12 cases were effective and 2 cases were ineffective，the total effective rate was 93.54%.However，the effect rate in Control group:6 cases were clinical cure，5 cases had marked effect，8 cases were effective and 12 cases were ineffective，the total effective rate was 61.29%.There was a significant difference between the two group（P＜0.05）.Before treatment，there was no significant difference in clinical symptoms scoring between two groups.After 2 weeks treatment，the arthralgia and morning stiffness in intervention group were obviously alleviate，the joint function recovered partially.After 4 weeks treatment，joint pain significantly reduced，morning stiffness and joint motion disappeared.By comparing，there were obvious differences（P＜0.05）.Before the treatment，the expression of GDF-5，VEGF in both groups were lower；but they were the increment after treatment.By comparison，there was statistical difference（P＜0.05）.Conclusion:Modified Dangguisini decoction exerts a distinct effect on improving symptoms of KOA by enhancing the expression of GDF-5 and VEGF.It is worthy of popularization and application.

Knee osteoarthritis；GDF-5；VEGF；Modified Dangguisini decoction

R684.3

Bdoi:10.13638/j.issn.1671-4040.2016.07.008

2016-05-12）