復方片仔癀肝寶對酒精誘導的慢性肝損傷氧化應激的保護作用研究*

陳達鑫　林珊　趙錦燕　曾建偉　洪振豐#

（1福建中醫藥大學中西醫結合研究院　福州350122；2福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室　福州350122）

復方片仔癀肝寶對酒精誘導的慢性肝損傷氧化應激的保護作用研究*

陳達鑫1，2林珊1，2趙錦燕1，2曾建偉1，2洪振豐1，2#

（1福建中醫藥大學中西醫結合研究院福州350122；2福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室福州350122）

目的：探討復方片仔癀肝寶對酒精性肝病（Aleoholie Liver Disease，ALD）模型大鼠氧化應激的保護作用。方法：60只SPF級SD大鼠，隨機分為正常對照組、模型組、陽性藥對照組及肝寶低、中、高劑量組，每組10只。除正常對照組外其余各組用酒精聯合高脂飼料喂養2周，造ALD模型，連續給藥4周后取材。全自動生化儀檢測血清中谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、乳酸脫氫酶（LDH）的含量變化；檢測肝組織中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的表達；HE染色，觀察肝組織病理變化。結果：模型組血清中ALT、AST、ALP、LDH的活性較正常對照組均有明顯的上升，且肝組織中MDA水平明顯上升，SOD、GSH-Px水平明顯下降（P＜0.01）。與模型組相比，肝寶各組ALT、AST、ALP、LDH的活性及MDA水平明顯降低，而SOD、GSH-Px水平明顯上升（P＜0.05）。HE染色結果顯示復方片仔癀肝寶不同劑量組對肝組織脂肪變性、肝內脂類聚集有明顯的改善作用，并且存在劑量效應關系。結論：復方片仔癀肝寶能顯著減輕酒精和高脂誘導的肝損傷，其機制可能與提高肝組織的抗氧化能力有關。

酒精性肝損傷；片仔癀肝寶；氧化應激

酒精性肝病（Alcoholie Liver Disease，ALD）表現多樣，初期通常表現為酒精性脂肪肝（Alcoholic Fatty Liver，AFL），進而可發展成酒精性肝炎（Alcoholic Hepatitis，AH）、酒 精 性 肝 纖 維 化（Alcoholic Liver Fibosis，ALF） 和酒精性肝硬化（Alcoholic Liver Cirrhosis，ALC），臨床上將這些疾病統稱為ALD［1］。ALD是西方國家最常見的肝病，在我國發病率有增多的趨勢，防治ALD已成為保護人類健康的重要醫學問題。現代醫學對肝損傷的研究比較深入，但療效尚難盡如人意，所用的藥物因毒副作用多、價格高昂等問題，限制了其臨床應用。中醫藥治療肝損傷的臨床優勢越來越受到國內外專家的重視和肯定，其多途徑、多層次、多靶點的治療作用日益受到國內外的肯定，故深入探索有效的抗肝損傷方藥具有十分深遠的意義。復方片仔癀肝寶是一種由多種中草藥混合而成的中成藥制劑，含牛黃、三七、蛇膽、茵陳、龍膽草、梔子、白芍等名貴藥材，具有較好的保肝護肝作用［2～3］。本實驗以酒精和高脂喂養誘導慢性肝損傷模型，用復方片仔癀肝寶進行干預治療，研究探索復方片仔癀肝寶對慢性肝損傷的保護作用及其部分作用機制，為臨床應用提供實驗依據。

1　材料與方法

1.1實驗動物及飼養條件SD大鼠，SPF級，體重（200±20）g，雄性，許可證號：SCXK（滬）2008-0016，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供。動物實驗室，溫度20～24℃，濕度40%～70%［（50± 5）%］，風速0.1～0.2 m/s，氣流≥28次/min。

1.2實驗藥物及試劑片仔癀肝寶由福建省片仔癀藥業有限公司提供（批號：1406001）；SOD（貨號：A001-3）、MDA（貨號：A003-1）、GSP-Px（貨號：A005）試劑盒購自南京建成生物工程研究所。無水乙醇、分析純由上海凌峰化學試劑有限公司生產（批號：00130523）。

1.3儀器電子天平（FA1104N，上海民橋精密科學儀器有限公司）、低溫離心機（TGL-16G，上海安亭科學器材公司）、全自動生化分析儀（Bayer ADVIA2400，德國西門子公司）、低溫高速離心機（64R，美國貝克曼公司）、酶標儀（ELX808，德國寶特公司）。

2　實驗方法

2.1動物分組、模型制備及給藥SPF級雄性大鼠60只，體重（180±10）g，取10只作為正常對照組正常飼養，為防止對照組在長時間飼養后也出現脂肪肝的情況，依據經驗，每周給予2 d全粗糧飼料喂養。其余動物進行造模干預：以乙醇聯合高脂飼料干預，每日1次。造模前3 d以15%乙醇0.7 ml/100 g進行適應性灌胃。第4天開始每日定時以30%乙醇0.7 ml/100 g灌胃。兩周后，模型條件不變，造模大鼠隨機分成五組：水飛薊賓葡甲胺片陽性對照組（600 mg/kg）、模型陰性對照組、肝寶低劑量組（150 mg/kg）、肝寶中劑量組（300 mg/kg）、肝寶高劑量組（600 mg/kg）各10只。定時給藥，灌藥時間與灌乙醇時間間隔2 h。連續4周，正常對照組、模型陰性對照組灌胃等量醫用生理鹽水。第4周末次給藥24 h后，空腹用3%戊巴比妥鈉60 mg/kg腹腔注射麻醉，腹主動脈采血后，分離血清，-20℃保存，用于血液生化指標的測定；取肝臟，迅速分離，取肝右葉用4%多聚甲醛固定，用于HE染色。

2.2血液生化分析取大鼠腹主動脈血，2 000 r/min離心10 min，分離得到血清，應用全自動生化分析儀檢測大鼠血清中ALT、AST、ALP、LDH的活性。

2.3肝勻漿SOD、MDA、GSP-Px檢測4℃生理鹽水沖洗肝表面，稱取0.5 g肝組織，加入9 ml生理鹽水，剪碎，研磨，制備5%的肝勻漿，2 500 r/min離心10 min，取上清。BCA法測定蛋白質含量。按照試劑盒操作說明，檢測肝組織中SOD、MDA、GSP-Px的含量。

2.4 肝組織病理學觀察多聚甲醛固定的肝右葉組織制備石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察肝組織病理改變。

3　結果

3.1生化測定結果與正常對照組相比，模型組大鼠血清ALT、AST、ALP、LDH水平明顯高于正常組（P＜0.01）。各給藥組分別與模型組相比，陽性藥組血清ALT和AST活力明顯降低（P＜0.01），血清ALP和LDH存在降低趨勢，但無統計學意義（P＞0.05）；肝寶高劑量組血清ALT、LDH活力顯著降低（P＜0.01），AST和ALP水平下降（P＜0.05）；肝寶中劑量組ALT降低具有統計學差異（P＜0.05），AST、ALP、LDH有降低趨勢但無統計學差異（P＞0.05）；肝寶低劑量組肝寶高劑量組血清ALT、AST、LDH活力顯著降低（P＜0.05），ALP的降低無統計學差異（P＞0.05）。見表1。

表1　復方片仔癀肝寶對酒精誘導的慢性肝損傷肝功能恢復情況比較（U/L，x±s）

3.2肝寶對SOD、MDA及GSH-Px的影響通過檢測大鼠肝組織勻漿SOD、MDA以及GSH-Px的水平及活性觀察復方片仔癀肝寶對氧化應激的保護作用。與正常對照組相比較，模型組大鼠肝臟中SOD、GSH-Px活性顯著下降，而MDA的水平明顯升高（P＜0.01），提示酒精誘導的慢性肝損傷發生氧化應激反應；與模型組相比較，各用藥組肝組織SOD、GSH-Px活性增加，統計學意義顯著（P＜0.05），同時各用藥組MDA水平顯著降低（P＜0.01）。結果見表2、圖1。

表2　復方片仔癀肝寶對酒精誘導的慢性肝損傷氧化應激的保護作用（nmol/mg prot，x±s）

圖1　復方片仔癀肝寶對酒精誘導的慢性肝損傷氧化應激指標

3.3病理組織學結果光鏡下觀察6組大鼠肝臟病理組織學改變，正常對照組可見肝小葉輪廓清晰，小葉中央靜脈向四周呈放射狀排列，肝細胞排列尚整齊，細胞分界清，核圓，位于細胞中央，胞質豐富，呈嗜堿性；酒精模型組可見肝小葉結構破壞，肝板排列紊亂，呈點、片狀壞死，肝細胞腫脹明顯，胞質中可見大小不等、數量不一的圓形脂肪空泡，散在肝細胞嗜酸性變，小葉中央靜脈周圍和匯管區有炎細胞浸潤，有的肝細胞質中有紅色顆粒狀Mallory小體；肝寶治療組大鼠肝細胞濁腫明顯減輕，有散在炎細胞浸潤，肝細胞內偶有小脂滴。見圖2。

圖2　片仔癀肝寶對肝組織病理變化的影響（光學顯微鏡100×）

4　討論

本實驗采用酒精聯合高脂飲食誘導大鼠慢性肝損傷，觀察復方片仔癀肝寶對肝損傷的保護作用并探討其作用機制。肝損傷的發生機制非常復雜，大多與肝內脂質代謝異常、胰島素抵抗、脂質過氧化和氧化應激等因素有關，這些因素在肝損傷的發生發展過程中起了重要作用，其中肝組織的氧化應激越來越受到關注。

臨床上ALT和AST是最敏感的肝功能檢測指標，對反映肝細胞內線粒體膜的損傷有重要意義［4～5］。正常時，肝細胞中的ALT、AST無明顯外漏，故血清中的ALT、AST屬于正常較低的水平。當肝臟受到損害時，胞漿內的ALT和AST向肝血竇溢出，并進入周圍血流，血清ALT、AST活性增加，提示肝細胞破壞，細胞膜通透性增強及線粒體受到損傷。因此，ALT、AST能直接反應肝臟受損傷的程度。本實驗模型組大鼠血清中ALT、AST、ALP、LDH酶活性明顯升高，表明模型大鼠肝損傷明顯。給予不同劑量復方片仔癀肝寶和陽性藥物干預后大鼠血清中ALT、AST、ALP、LDH酶活性不同程度地降低，表明復方片仔癀肝保片對酒精誘導所致大鼠慢性肝損傷起到了明顯的保肝降酶作用。

SOD作為機體內重要的氧化自由基清除劑，是目前為止發現的唯一的以自由基為底物的酶，具有極強的抗炎癥作用［6］。GSH-Px是機體內廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶。SOD和GSH-Px對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用，它能清除體內的超氧陰離子、自由基保護細胞免受損傷。MDA是氧化應激和抗氧化劑狀態的標志物，是一種強有力的脂質過氧化產物，通常被作為脂質過氧化的判斷指標。因此，同時提高SOD、GSH-Px活性和降低肝MDA能對抗氧化應激狀態，提高肝臟抗氧化能力是防治肝損傷的有效途徑。本研究結果表明復方片仔癀肝寶可通過增加機體SOD和GSH-Px活性，增強機體抗氧化能力，加速自由基的清除，抑制脂質過氧化反應，清除過量的MDA，從而保護肝臟結構和功能。綜上所述，復方片仔癀肝寶能夠顯著改善ALD模型大鼠肝臟脂肪變性程度，降低血清ALT、AST、ALP、LDH水平，提示肝寶對ALD具有一定的防治作用，進一步研究發現其作用機制可能與通過增強抗氧化能力，降低肝內脂質過氧化反應，清除自由基有關。

［1］徐亮，宓余強.酒精性肝病治療進展［J］.實用肝臟病雜志，2014，17（1）: 89-91

［2］黃進明，趙錦燕，萬蕓，等.復方片仔癀肝寶對急性肝損傷的保護作用研究［J］.世界中西醫結合雜志，2015，10（9）:1216-1218

［3］洪緋，趙錦燕，張澤修，等.復方片仔癀肝保片對大鼠四氯化碳誘導的慢性肝損傷的治療作用［J］.福建中醫藥，2014，45（5）:53-60

［4］王越，沈連忠，李波.臨床前研究中肝損傷的臨床病理指標的選擇及意義［J］.中國藥事，2009，23（8）:813-816，825

［5］黃正明，楊新波，曹文斌，等.化學性及免疫性肝損傷模型的方法學研究［J］.解放軍藥學學報，2005，21（1）:42-46

［6］吳娜，蔡光明，何群.氧化應激與肝臟損傷［J］.世界華人消化雜志，2008，16（29）:3310-3315

Compound Pien Tze Huang Ganbao Protects Against Alcohol-induced Chronic Liver Injury Caused by Oxidative Stress

CHEN Da-xin1，2，LIN Shan1，2，ZHAO Jin-yan1，2，ZENG Jian-wei1，2，HONG Zhen-feng1，2#
（1Academy of Integrative Medicine，Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou350122；
2Fujian Key Laboratory of Integrative Medicine on Geriatric，Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou350122）

Objective:To determine the protective effect of Compound Pien Tze Huang Ganbao（GB）in alcoholic liver disease （ALD）using a rat model of oxidative stress.Methods:60 SPF SD rats were randomly divided into control group，model group，positive control group，GB low，medium and high dose groups（n=10 for each group）.All groups except control group were fed an alcohol and high fat diet for two weeks，as a model for ALD，and rats were sacrificed following 4 weeks of feeding.The level of expression of serum alanine aminotransferase（ALT），aspartate aminotransferase（AST），alkaline phosphatase（ALP）and lactate dehydrogenase（LDH）were detected with automatic biochemical analyzer，as well as the expression of superoxide dismutase（SOD），malondialdehyde（MDA）and glutathione peroxidase（GSH-Px）in liver tissue.Using HE staining，pathological changes were observed in liver tissue.Results:In the ALD model group，the activity of ALT，AST，ALP and LDH significantly increased compared to the control group.In addition，in liver tissue the level of MDA significantly increased too，whereas levels of SOD and GSH-Px significantly decreased（P＜0.01）.Compared with the ALD model group，in GB treated group activity of ALT，AST，ALP，LDH and the expression of MDA significantly decreased，whereas SOD and GSH-Px levels significantly increased（P＜0.05）.HE staining showed that different doses of GB resulted in significant improvements in hepatic steatosis and hepatic lipid accumulation with a dose-response relationship.Conclusion:Complex prescription Pien Tze Huang Ganbao can significantly reduce fat and alcohol-induced liver damage，which may be beneficial in improving the antioxidant capacity of liver tissue.

Pien Tze Huang Ganbao；Alcoholic liver disease；Oxidative stress

R575.2

Bdoi:10.13638/j.issn.1671-4040.2016.07.002

2016-06-08）

·綜合報道·

福建省科技廳項目（編號：2010YZ0001-1）

洪振豐，E-mail：zfhong1953@163.com