老黑谷米中多酚化合物的提取及體外抗氧化活性研究

陸　洋，楊士花，黃佳琦，陶　亮，初雅潔，黃勇樺，李華君，李永強

(1 云南省高原特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)研究院，昆明　650201；2云南農(nóng)業(yè)大學外語學院，昆明　650201；3云南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，昆明　650201；4云南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，昆明　650201)

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老黑谷米中多酚化合物的提取及體外抗氧化活性研究

陸洋1，楊士花2，黃佳琦3，陶亮4，初雅潔3，黃勇樺3，李華君3，李永強3

(1云南省高原特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)研究院，昆明650201；2云南農(nóng)業(yè)大學外語學院，昆明650201；3云南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，昆明650201；4云南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，昆明650201)

以老黑谷米面粉為原料，提取分離其中的可溶性多酚、游離多酚、酯化多酚、醚化多酚、鍵合多酚，利用比色法進行多酚和類黃酮含量測定，并采用DPPH自由基清除能力、鐵離子還原/抗氧化能力測定(FRAP)、總抗氧化能力測定(TEAC)、還原能力測定(RP)和H2O2清除活性等5種不同的體外抗氧化測定體系進行抗氧化活性測定。結(jié)果表明：5種多酚中，可溶性多酚含量最高，酯化多酚含量次之，顯著高于游離多酚、醚化多酚、鍵合多酚。多酚中類黃酮含量最高為鍵和多酚和可溶性多酚，顯著高于其他3種多酚。5種多酚均有較高的體外抗氧化能力，鍵合多酚的DPPH自由基清除能力最高，可溶性多酚的H2O2清除能力、FRAP還原能力、RP還原能力和TEAC總抗氧化能力最高。本研究為老黑谷米的開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

老黑谷米；多酚；提取；抗氧化活性

自由基在生命系統(tǒng)中天然存在，以活性氧的形式產(chǎn)生，大量的自由基能夠氧化生物大分子，導致組織損傷，細胞死亡或退化，引發(fā)各種疾病[1]。多酚化合物作為膳食中最豐富的一類抗氧化物質(zhì)，能夠清除體內(nèi)自由基[1，2]。20世紀90年代以來，流行病學研究表明，食物中攝入的多酚化合物能夠促進人體健康，預(yù)防各種高發(fā)的慢性疾病[3]。酚類物質(zhì)在高等植物組織中廣泛存在，水果、蔬菜和谷物中均含有豐富的多酚化合物[4-8]。谷物中95%的多酚和細胞壁多糖緊密結(jié)合，研究者提出了“膳食纖維抗氧化劑”和“膳食纖維-多酚復合物”的概念，認為谷物膳食纖維是體內(nèi)傳送多酚化合物的天然功能成分[9-11]。

老黑谷米是云南省迪慶藏族自治州維西傈僳族自治縣攀天閣特有的水稻品種，有近750多年的種植歷史，是高原地區(qū)唯一能完全成熟的谷類物種。老黑谷米米殼呈黑，米粒潤紅飽滿，煮熟后飯粒為紅色，當?shù)厝苏J為吃了老黑谷米能夠補足精氣、強健體魄，具有較高的開發(fā)價值。目前，關(guān)于老黑谷米中多酚化合物的相關(guān)研究未見報道。本研究首次采用老黑谷米為原料，提取分離老黑谷米面粉中的可溶性多酚、游離多酚、酯化多酚、醚化多酚、鍵合多酚，對多酚含量、類黃酮含量進行測定，并采用5種不同的體外抗氧化測定體系進行抗氧化活性測定，為開發(fā)利用老黑谷米中多酚化合物提供科學依據(jù)，也為老黑谷米的深加工提供新的思路。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

老黑谷米：云南省迪慶藏族自治州維西傈僳族自治縣；2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(DPPH)、三吡啶基三嗪(TPTZ)、六水三氯化鐵(FeCl3·6H2O)、過氧化氫(H2O2)、2，2′-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、七水硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)、抗壞血酸：上海晶純生化科技股份有限公司；Folin-Ciocalteu試劑、Trolox：sigam公司；阿魏酸、兒茶素：北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；無水氯化鋁：山東西亞化學工業(yè)有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

TDL-5-A離心機：上海安亭科學儀器廠；UV-1800CP紫外分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；JFS-13A旋風式粉碎磨：杭州錢江儀器設(shè)備有限公司；ZWF-334多功能脫色搖床：上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3方法

1.3.1老黑谷米中多酚化合物的提取[5，10]

(1)可溶性多酚的提取老黑谷米磨粉后過50目篩，脫脂后，準確稱取1.5g，用70%丙酮避光振搖提取，料液比為1∶20，提取2h后，4 000g離心10min，提取3次，合并上清，30℃真空濃縮蒸干，用甲醇定容至25mL，得到可溶性多酚，4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

(2)游離多酚的提取可溶性多酚調(diào)節(jié)pH為2后，用乙醚萃取3次，合并有機相，于30℃真空濃縮蒸干，用甲醇定容至25mL，得到游離多酚，4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

(3)酯化多酚的提取游離多酚水相用2mol/L NaOH室溫下水解4h，調(diào)節(jié)pH為2后，4 000g離心10min，上清用乙醚與乙酸乙酯(V∶V=1∶1)混合溶劑萃取3次，合并有機相，于30℃真空濃縮蒸干，用甲醇定容至25 mL，得到酯化多酚，4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

(4)醚化多酚的提取酯化多酚水相加入1mol/L HCl 20mL，90℃水浴45min，用乙醚萃取3次，合并有機相，于30℃真空濃縮蒸干，用甲醇定容至25mL，得到醚化多酚，4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

(5)鍵合多酚的提取提取可溶性多酚后得到的殘渣加入4mol/L NaOH 40mL，室溫下水解4h后，調(diào)節(jié)pH為2，4 000g離心10min，上清用乙醚與乙酸乙酯(V∶V=1∶1)混合溶劑萃取3次，合并有機相，于30℃真空濃縮蒸干，用甲醇定容至25mL，得到鍵合多酚，4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2多酚化合物含量測定多酚含量采用Folin-Ciocalteau法進行測定[12]，具體步驟如下：吸取多酚粗提液0.5mL，加入0.5mL Folin-Ciocalteau試劑，充分振搖，加入1mL飽和碳酸鈉溶液，加蒸餾水使總體積至10mL，充分混勻，室溫下避光反應(yīng)35min，4 000g離心10min，在725nm波長處測定吸光度，用甲醇代替多酚粗提液作為空白。以阿魏酸為標準品，建立回歸方程為：

y=0.006 6x-0.003 0(7.92-55.44μg /mL，R2=0.998 8)

(1)

(1)式中，y為吸光度、x為阿魏酸濃度(μg/mL)，多酚含量以每g干燥面粉樣品中阿魏酸當量(μg)表示。1.3.3類黃酮含量測定[2，5]采用AlCl3比色法進行測定，具體步驟為：吸取2mL多酚粗體液，依次加入4mL蒸餾水、0.3mL 5%亞硝酸鈉溶液，室溫下反應(yīng)5min后；加入0.3mL 10%氯化鋁溶液充分混合，室溫下反應(yīng)1min；再加入2mL 1mol/L NaOH溶液，并加蒸餾水至反應(yīng)體系總體積為10mL，室溫下反應(yīng)15min；4 000g離心10min，上清于510nm處測定吸光度，用甲醇替代多酚溶液作為空白。用兒茶素制作標準曲線，建立回歸方程為：

y=0.0027x-0.0114(7.92-55.44μg/mL，R2=0.999 8)

(2)

(2)式中，y為吸光度、x為兒茶素濃度(μg/mL)，類黃酮含量以每g干燥樣品中兒茶素當量(μg)表示。

1.3.4抗氧化能力測定

(1)DPPH自由基清除能力測定[13，14，17]：分別吸取0.5mL多酚粗提液，添加2mL 0.19mmol/L DPPH溶液，充分振搖后，室溫下暗處放置10min，然后在517nm比色測定，用甲醇替代多酚溶液作為空白。用阿魏酸繪制標準曲線，建立回歸方程為：

y=0.940 6x+28.698(23.2-139.2μg/mL，R2=0.969)

(3)

DPPH自由基清除能力(%)=[(A0-A1)/A0]×100

(4)

(4)式中，A0為空白吸光度、A1為樣品吸光度。

(2)鐵離子還原/抗氧化能力測定(FRAP)[14，18，19]FRAP溶液的配制：乙酸溶液(300mmol/L，pH為3.6)、六水三氯化鐵(20mmol/L)和三吡啶基三嗪(10mmol/L)以10∶1∶1(V∶V∶V)充分混勻。

吸取100μL多酚粗提液加入3mLFRAP溶液充分混合，于37℃反應(yīng)4min，在593nm測定吸光度，用甲醇替代多酚溶液作為空白。用硫酸亞鐵繪制標準曲線，建立回歸方程為：

y=6.24x+0.000 5(0.2-1.2mmol/L，R2=0.998 4)

(5)

(5)式中，y為吸光度、x為硫酸亞鐵濃度(mmol/L)，還原能力表示為每mL多酚粗提液中Fe2+當量(mmol)。

(3)總抗氧化能力測定(TEAC)[13-16]：ABTS·+工作液的配制：將ABTS(7mmol/L)和過硫酸鉀(2.45mmol/L)兩種溶液等體積混合，于4℃下反應(yīng)16h，得到ABTS·+工作液。

吸取100μL多酚粗提液，加入3.8mLABTS·+工作液，室溫下反應(yīng)6min，于734nm測定吸光度，用甲醇替代多酚溶液作為空白。用Trolox繪制標準曲線，建立回歸方程為：

2.在浦東開發(fā)區(qū)內(nèi)，進口必要的建設(shè)用機器設(shè)備、車輛、建材，免征關(guān)稅和工商統(tǒng)一稅。區(qū)內(nèi)的“三資”企業(yè)進口生產(chǎn)用的設(shè)備、原輔材料、運輸車輛、自用辦公用品及外商安家用品、交通工具，免征關(guān)稅和工商統(tǒng)一稅；凡符合國家規(guī)定的產(chǎn)品出口，免征出口關(guān)稅和工商統(tǒng)一稅。

y=5.382 7x+3.3472(7.488-37.44μg/mL，R2=0.999 7)

(6)

(6)式中，y為ABTS·+自由基清除能力、x為Trolox濃度(μg/mL)，自由基清除能力表示為每g干燥樣品中Trolox當量(μg)。

ABTS·+自由基清除能力(%)=[(A0-A1)/A0]×100

(7)

(7)式中，A0為空白吸光度、A1為樣品吸光度。

(4)還原能力測定(RP)[5]：吸取1mL多酚粗提液，加入2.5mL磷酸鹽緩沖溶液(0.2mol/L，pH6.6)，加入2.5mL1%鐵氰化鉀溶液，充分混勻后于50℃水浴反應(yīng)20min；再加入2.5mL10%TCA溶液，4 000g離心10min；吸取上清1mL，加入2.5mL蒸餾水和0.5mL0.1%FeCl3溶液，于700nm測定吸光度，用甲醇替代多酚溶液作為空白。用抗壞血酸(維生素C)繪制標準曲線，建立回歸方程為：

y=0.045 5x-0.115(80-180μg/mL，R2=0.9916)(8)

(8)式中，y為吸光度、x為維生素C濃度(μg/mL)。還原能力表示為每g干燥樣品中維生素C當量(μg)。

(5)H2O2清除活性測定[1，17]吸取0.6mL多酚粗提液，加入0.9mLH2O2(40mmol/L)，加入磷酸鈉緩沖溶液(45mmol/L，pH7.4)，30℃反應(yīng)40min，于230nm測定吸光度，用甲醇替代多酚溶液作為空白。用阿魏酸繪制標準曲線，建立回歸方程為：y=0.657 1x-11.119(55-275μg/mL，R2=0.994 3)(9)

(9)式中，y為H2O2清除能力、x為阿魏酸濃度(μg/mL)，自由基清除能力表示為每g干燥樣品中阿魏酸當量(μg)。

H2O2清除活性(%)=[(A0-A1)/A0]×100(10)

(10)式中，A0為空白吸光度、A1為樣品吸光度。

2　結(jié)果與分析

2.1多酚化合物與類黃酮含量測定

由老黑谷米面粉中各類多酚和類黃酮含量測定結(jié)果見可知，老黑谷米面粉中可溶性多酚含量最高，為7 876.72±195.82μg/g，顯著高于其他各類多酚；酯化多酚含量為1 278.32±349.17μg/g；可溶性多酚和酯化多酚含量顯著高于游離多酚、醚化多酚、鍵合多酚；游離多酚、醚化多酚、鍵合多酚含量差異不顯著。5種多酚的類黃酮含量最高為鍵和多酚和可溶性多酚，分別為829.99±42.16、800.13±110.18μg/g，顯著高于其他3種多酚；醚化多酚類黃酮含量最低，為62.82±14.77μg/g，顯著低于其他4種多酚(表1)。

表1　老黑谷米面粉中各類多酚和類黃酮含量(μg/g面粉)

2.2多酚抗氧化能力測定

各類多酚5種體外抗氧化能力測定結(jié)果見表2。

2.2.1DPPH清除能力測定DPPH·是人工合成的能穩(wěn)定存在的自由基，其乙醇溶液呈深紫色，在可見光區(qū)517nm處被吸收。當多酚加入DPPH溶液中時，溶液褪色，多酚含量與褪色程度呈正相關(guān)。由表2可知，鍵合多酚對DPPH自由基的清除能力最強，顯著高于其他多酚，游離多酚和酯化多酚清除能力次之，醚化多酚和可溶性多酚的清除能力顯著低于其他多酚。

表2　不同多酚的抗氧化能力測定(以每g面粉計)

2.2.2鐵離子還原/抗氧化能力測定(FRAP)多酚將Fe3+還原為Fe2+，F(xiàn)e2+與TPTZ結(jié)合生成藍色絡(luò)合物，在波長593nm處有最大吸收。吸光度越大，表明還原/抗氧化能力越強。由表2可知，可溶性多酚的還原/抗氧化能力顯著高于其他多酚，F(xiàn)e2+濃度當量為54.70±1.17mmol/L；醚化多酚還原/抗氧化能力次之，F(xiàn)e2+濃度當量為11.35±0.59mmol/L；游離酚酸、醚化多酚、鍵合多酚還原/抗氧化能力最弱，F(xiàn)e2+濃度當量分別為5.25±0.08、4.05±0.10、3.97±0.12mmol/L。

2.2.3還原能力測定(RP)由表2可知，5種多酚多酚還原能力為可溶性多酚>醚化多酚>游離多酚>酯化多酚>鍵合多酚，其中各種多酚維生素C當量分別為453.77±10.27、178.00±11.92、75.02±1.68、72.63±4.05、54.14±0.25μg/g，可溶性多酚和醚化多酚的還原能力顯著高于其他3種多酚。

2.2.4H2O2清除能力測定由表2可知，可溶性多酚對H2O2清除能力顯著高于其他多酚，阿魏酸當量為389 196.83±8 430.32μg；酯化多酚清除能力次之，阿魏酸當量為196 840.57±98 354.23μg；鍵合多酚和醚化多酚的清除能力最低，阿魏酸當量分別為55 617.11±6 344.29、51 045.31±8 979.84μg。

2.2.5總抗氧化能力測定(TEAC)ABTS·+為穩(wěn)定的有機自由基，多酚抗氧化能力越強，其提供電子的能力也就越強，與該有機自由基反應(yīng)量越大，反應(yīng)速率也越快，通過測定反應(yīng)液吸光度的變化，直接反應(yīng)出樣品抗氧化能力的大小。由表2可知，可溶性多酚總抗氧化能力最高，相當于505 287.97±80 123.49μgTrolox，顯著高于其他4種多酚；其他4種多酚之間總抗氧化能力差異不顯著。

3　結(jié)論

5種多酚中，可溶性多酚含量最高，酯化多酚含量次之，兩者含量顯著高于游離多酚、醚化多酚、鍵合多酚；多酚中類黃酮含量最高為鍵和多酚和可溶性多酚，顯著高于其他3種多酚。5種多酚均有較高的體外抗氧化能力，鍵和多酚的DPPH自由基清除能力最高，可溶性多酚的H2O2清除能力、FRAP還原能力、RP還原能力和TEAC總抗氧化能力最高。◇

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(責任編輯李燕妮)

Extraction of Polyphenols from Old Black Rice and Its Antioxidant Activity in Vitro

LU Yang1，YANG Shi-hua2，HUANG Jia-qi3，TAO Liang4，CHU Ya-jie3，HUANG Yong-hua3，LI Hua-jun3，LI Yong-qiang3(1Yunnan Plateau Characteristic Agricultural Industry Research Institute，Kunming 650201, China；2College of Foreign Languages，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201, China；3College of Food Science and Technology，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201, China；4College of Plant Protection，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201, China)

Soluble，free，esterified，etherified，insolubleboundpolyphenolswereextractedfromoldblackriceandthecontentofphenoliccompoundsandflavonoidsweredeterminedusingcolorimetry.Antioxidantactivitiesofphenolicfractionswereestimatedusing2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH)radicalscavengingactivity，ferricreducingantioxidantpower(FRAP)，troloxequivalentantioxidantcapacity(TEAC)，reducingpower(RP)andhydrogenperoxide(H2O2)scavengingactivityin vitro.Resultsshowedthatsolublepolyphenolhadthehighestcontent，esterifiedpolyphenolhadthesecondcontent，thetwofractionsweresignificantlyhigherthanothers.Boundpolyphenolandsolublepolyphenolhadthehighestflavonoidcontent，whereastheotherthreefractionspossessedthelower.Allpolyphenolsshowedhighantioxidantactivities.BoundpolyphenolhadhighestDPPHradicalscavengingactivity，solublepolyphenolhadthehighestferricreducingantioxidantpower(FRAP)，troloxequivalentantioxidantcapacity(TEAC)，reducingpower(RP)andhydrogenperoxide(H2O2)scavengingactivity.Theseresearchresultscouldbeusedasthebaseforfurtherresearchanddevelopmentofoldblackrice.

oldblackrice；polyphenols；extraction；antioxidantactivity

國家自然科學基金項目(項目編號：31360378)；云南省自然科學基金項目(項目編號：2013FB042)；云南省教育廳項目(云南省高校食品加工與安全控制重點實驗室)；國家大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(項目編號：201510676001)。

陸洋(1984—)，女，碩士，研究方向：功能食品。

李永強(1975—)，男，博士，副教授，研究方向：功能食品與天然產(chǎn)物化學。