巴西橡膠樹響應乙烯利刺激的生理及其分子調控機制研究進展

位明明 李維國 高新生 黃肖

（中國熱帶農業科學院橡膠研究所 國家橡膠樹育種中心 農業部橡膠樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室，儋州 571737）

巴西橡膠樹響應乙烯利刺激的生理及其分子調控機制研究進展

位明明 李維國 高新生 黃肖

（中國熱帶農業科學院橡膠研究所 國家橡膠樹育種中心 農業部橡膠樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室，儋州 571737）

生產中施用乙烯利刺激已成為提高橡膠樹產量的重要手段，并在天然橡膠生產中大面積推廣應用。然而，關于橡膠樹響應乙烯利刺激的調控機制尚不清晰，成為橡膠樹新型刺激劑研制，以及耐乙烯利刺激新品種選育中亟待解決的問題之一。綜述了近年來橡膠樹乙烯信號轉導通路相關基因的研究現狀，橡膠樹響應乙烯利刺激的生物學調控機制研究進展，以及乙烯利刺激對橡膠樹的副作用，以期為深入研究橡膠樹響應乙烯利刺激的分子機制提供參考。

橡膠樹；乙烯利；調控機制

巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）屬大戟科橡膠樹屬，為多年生異花授粉喬木，其合成的天然橡膠能廣泛應用于國防建設和國民經濟生產的各個領域，具有重要的戰略意義和經濟價值［1］。由于中國地處熱帶北緣，風害與寒害頻發，適合橡膠樹種植的區域極為有限，使得國內天然橡膠供需矛盾尤為突出，提高橡膠樹單位面積產量成為解決天然橡膠供需矛盾的最有效途徑之一［2］。

目前，乙烯利刺激作為橡膠樹增產的重要手段和主要刺激因子，已被廣泛應用于天然橡膠生產［3］。研究表明涂施乙烯利可促使橡膠樹膠乳產量增加1.5-2倍，被譽為天然橡膠產業的第二次技術革命［4］。作為現代割膠制度的重要組成部分，中國在2006 年新頒布的《橡膠樹割膠技術規程》中也提出推廣乙烯利刺激割膠制度［5］。根據該規程的建議，橡膠樹傳統割膠方式要逐步向乙烯利刺激的低頻高效方向轉變，以藥代工，以藥代皮，降低割膠頻率，提高割膠效率和效益［6］。然而，迄今關于橡膠樹響應乙烯利刺激的分子機制尚不清晰。此外，高濃度乙烯利刺激割膠后，容易導致橡膠樹死皮病（橡膠樹割面乳管發生生理性病變，導致樹皮干涸，乳管喪失排膠功能的現象）的發生，嚴重影響天然橡膠的可持續性發展［7］，已成為天然橡膠生產中亟待解決的問題之一。因此，積極開展橡膠樹響應乙烯利刺激的分子調控機制研究，不僅對于合理指導乙烯利刺激技術、研制高效、低傷害的新型刺激劑，以及乙烯利精準施藥具有一定的實踐指導意義，而且可為橡膠樹耐乙烯利刺激新品種選育提供理論依據與技術手段。本文綜述了橡膠樹中乙烯信號轉導通路相關基因的研究現狀，橡膠樹響應乙烯利刺激的生理生化及分子生物學基礎，以及乙烯利對橡膠樹的副作用，以期為今后深入研究橡膠樹響應乙烯利刺激的分子機制提供參考。

1 橡膠樹中乙烯合成通路及信號轉導通路

1.1 植物中乙烯生物合成通路

乙烯作為植物生長發育中重要的激素調控因子，在植物生長周期的多個階段發揮著重要作用。在植物體內乙烯的生物合成通路已經十分清楚，其生物合成所需最基本的前體物質為蛋氨酸，首先蛋氨酸在腺苷蛋氨酸合成酶的作用下，轉化成S-腺苷蛋氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）；接著SAM在氨基環丙烷羧酸（ACC）合成酶的催化反應下合成ACC；最后ACC在ACC氧化酶（ACO）的催化下氧化生成乙烯［8］。

多年來對乙烯信號轉導通路的研究已經揭示出導致轉錄因子激活的線性通路，這些轉錄因子屬于乙烯響應因子（ethylene response factor，ERF）家族。ERF作為轉錄因子家族中最重要的一類成員，它們在生物脅迫及非生物脅迫的激素、糖信號及氧化還原信號中起關鍵作用［9］。ERF具有一個保守的AP2結構域，能參與DNA綁定，該區域大約由60個氨基酸殘基組成，能識別下游靶基因的GCC/DRE盒子。根據AP2保守結構域不同，Nakano 等［10］和Sakuma 等［11］將ERF劃分為10種或數個不同的亞家族，其中絕大多數物種中ERF屬于AP2/ERF亞家族。

1.2 橡膠樹中乙烯合成及信號轉導通路

目前，橡膠樹中乙烯合成及信號通路已被廣泛研究［12-14］。借助于新一代高通量測序技術，前人已從橡膠樹的膠乳、樹皮、葉片、莖及體細胞胚等不同組織中鑒定出172個包含AP2結構域的轉錄因子，其中142個轉錄因子具有完整的AP2結構域［15］。在橡膠樹中ERF家族有115個成員組成，它們被劃分為10個主要的亞家族，其中50%以上HbERF屬于VII、VIII和IX亞組。進一步研究證實一些HbERF基因的表達與體細胞胚胎發生［16］、乳管分化［17］及非生物脅迫密切相關［18］，表明乙烯信號通路相關基因在橡膠樹的生長發育與膠乳代謝過程中起重要作用。

2 乙烯刺激橡膠樹增產的生理生化和分子生物學基礎

2.1 天然橡膠的合成部位及途徑

巴西橡膠樹合成的天然橡膠儲藏與樹皮的乳管中，待橡膠樹成齡后，膠工以切割樹皮乳管的方式來收集膠乳，獲取天然橡膠。橡膠樹合成的天然橡膠主要成分是順式-聚異戊二烯，其生物合成過程屬于典型的植物類異戊二烯次生代謝途徑，進一步研究表明天然橡膠是在乳管細胞質的橡膠粒子表面合成［19］，是一個酶促順-1，4-異戊二烯聚合到長鏈的聚異戊二烯橡膠分子的過程。

目前天然橡膠的生物合成途徑已大致了解，其生物合成過程大致分為3個階段［20，21］：（1）乙酰-CoA的形成：天然橡膠的生物合成首先是以蔗糖為原料，經過糖酵解和三羧酸循環生成乙酰輔酶A。（2）異戊二烯類化合物的生成：利用ATP為能量，以磷酸戊糖途徑產生的NADPH為還原劑，乙酰輔酶A轉變為甲羥戊酸（mevalonic acid，MVA），再由MVA轉變成異戊烯基焦磷酸（isopenteny diphosphate，IPP），接著IPP在IPP異構酶的催化作用下生成二甲基丙烯基焦磷酸（dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP或DMADP）。（3）IPP聚合形成橡膠分子：IPP 在反式異戊二烯轉移酶（farnesyl pyrophosphate，FPP或FDP）的催化下，將IPPs 加在DMAPP 上生成C10、C15等異戊二烯類化合物，在橡膠轉移酶催化下，IPP 添加到異戊二烯類化合物上形成橡膠分子，該過程包括橡膠分子的起始、延伸和終止等3步。前期對天然橡膠合成通路相關酶類的研究分析表明：橡膠樹乳管細胞中3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A 還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，HMGR）、法尼基二磷酸合酶（farnesyl diphosphate synthase，FDP）及橡膠轉移酶（rubber transferase，RuT）是天然橡膠合成途徑中3個關鍵性限速酶［22］，它們對于天然橡膠的生物合成具有重要意義。

2.2 橡膠樹響應乙烯利刺激的生理生化基礎

自20世紀60年代，研究人員發現乙烯利作為一種能夠顯著提高膠乳產量的采膠刺激劑以來，關于橡膠樹響應乙烯利刺激的生理及分子調控機理研究就未中斷過。早期有關乙烯利刺激對橡膠樹作用機制的研究多集中在產量效應和生理參數方面，分析乙烯利刺激對橡膠樹膠乳代謝過程中相關生理生化指標的影響及變化規律是這些研究的主要內容。如D'Auzac等［23］認為乙烯利涂抹于橡膠樹割面后，可以增加樹皮內層乳管細胞的澎壓與可塑性，以及降低膠乳凝聚來增加膠乳外流時間，從而提高橡膠樹產量。Sainoi和Sdoodee［24］報道施用乙烯利刺激后對橡膠樹膠乳生理產生一定影響，使得膠乳穩定性增強。Tupy［25］發現外源乙烯可促進橡膠樹韌皮部和木質部中淀粉的水解，加速水分和養分的吸收。Jetro和 Simon［26］發現橡膠樹涂施乙烯利后，不僅對其膠乳產量和膠乳生理產生影響，而且這種影響隨著橡膠樹生長季節的變化而變化。

總之，在膠乳代謝的生理生化水平，早期有關乙烯利刺激對橡膠樹作用機制的研究觀點主要集中在以下兩個方面：第一種觀點認為乙烯利刺激不僅能提高橡膠樹膠乳代謝活性，使得膠乳穩定性增強，排膠時間延長，而且還能擴大橡膠樹排膠影響面，增強乳管中膠乳再生能力，從而獲得較高產量；第二種觀點認為乙烯利在橡膠樹產膠系統中能通過誘發酶的合成和調節酶活性［27］，導致膠乳流速加快，增強排膠功能，從而有利于多聚異戊二烯的合成與再生。

2.3 橡膠樹響應乙烯利刺激的分子生物學基礎

乙烯利對橡膠樹的作用機制首先涉及乙烯信號轉導，揭示乙烯利刺激橡膠樹增產過程中的乙烯信號轉導通路可能是揭示乙烯利刺激橡膠樹增產的關鍵。隨著分子生物學的飛速發展，分析橡膠樹膠乳代謝相關基因的乙烯利調控模式對其產量的影響成為相關研究的主要內容［28］。由于天然橡膠的生物合成涉及產膠、排膠及乳管發育等3個主要生物學過程，前人圍繞乙烯利刺激橡膠樹增產的研究主要集中在以上3個方面。

2.3.1 乙烯利促進產膠及其機制 橡膠樹所產膠乳中90%以上的干物質是橡膠烴，而橡膠烴的合成代謝與糖酵解途徑密切相關，因此，膠乳中蔗糖含量及其代謝強度是影響橡膠生物合成的第一限制因子。諸多研究證實乙烯利刺激橡膠樹后蔗糖轉運和代謝加速可能是影響乙烯利刺激橡膠樹增產的主要原因。如Tupy［29］證實乙烯利刺激能顯著提高橡膠樹膠乳中轉化酶的活性，從而加速糖酵解過程，提高蔗糖和水分等物質對乳管的供應，為膠乳代謝和橡膠的合成和再生提供有利條件。Gidrol等［30］研究表明乙烯利處理橡膠樹后12-72 h內，原生質膜上的ATPase酶活性提高了2-4倍，且ATP/ADP 比值與膠乳產量呈極顯著相關，激活的ATPase酶可提供蔗糖運輸所需要的能量，表明乙烯利刺激能促使蔗糖轉運加速，從而增強產膠過程。Dusotoit-Coucaud等［31］研究表明乙烯利處理后膠乳中兩個蔗糖轉運蛋白基因HbSUT1A和HbSUT2A的表達均受到乙烯利的誘導，從而證實乙烯利刺激可通過轉運蔗糖進入乳管的方式參與橡膠樹增產的過程。黃德寶等［32］利用RT-PCR和RACE技術，從橡膠樹中克隆了6個蔗糖轉運蛋白基因的全長cDNA，分別將其命名為：HbSUT1、HbSUT2A、HbSUT2B、HbSUT3、HbSUT4和HbSUT5，進一步研究分析表明乙烯利刺激能夠上調HbSUT2A、HbSUT2B和HbSUT3的表達，暗示這3個蔗糖轉運蛋白基因可能共同參與了乳管的蔗糖供給，與乙烯利刺激增強乳管代謝能力相關。隨后，李和平等［33］又對HbSUT5基因進行功能分析，結果表明HbSUT5基因在膠乳、樹皮及葉片中均呈高豐度表達，而且該基因在葉片發育早期表達豐度最高，之后隨葉片發育進程表達量呈逐步下降趨勢。然而，進一步研究表明HbSUT5基因在膠乳中的表達卻不受乙烯利誘導，這種表達模式與決定乳管蔗糖供給和橡膠產量的關鍵基因HbSUT3明顯不同，初步認為HbSUT5基因可能在橡膠樹幼嫩組織發育的“碳源”供給上起作用，參與了對乳管蔗糖供給的調控。陳鑫等［34］通過篩選乙烯利刺激條件下巴西橡膠樹膠乳和未處理膠乳差異表達的cDNA消減文庫，克隆到一個編碼鈣依賴蛋白激酶的基因HbCDPK1，進一步研究分析表明該基因不僅具有明顯的組織特異性，其在膠乳中的表達量明顯高于其他組織，而且能夠參與調控蔗糖代謝。此外，該基因在膠乳中的表達亦受到茉莉酸、乙烯、機械傷害的誘導，表明HbCDPK1通過多種方式參與膠乳合成相關的蔗糖代謝調控。

在產膠方面，關于乙烯利刺激對天然橡膠合成通路相關基因的表達模式是否能產生影響，前人也開展了相關研究，但至今無任何直接證據表明乙烯利能夠促進天然橡膠合成途徑中關鍵酶基因的表達［35］。許多研究證實乙烯利對橡膠生物合成主要途徑中關鍵酶基因的表達無顯著影響，如3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A 還原酶、法尼基二磷酸合酶，以及橡膠延伸因子和小橡膠粒子蛋白的基因表達均不受乙烯利調節［36-38］。此外，還有研究證明乙烯利不能促進膠乳反式異戊烯基轉移酶（tranprenyl transferase，FPP）基因的表達［39］，而FPP是橡膠生物合成的重要限制因子之一，它對橡膠生物合成的啟動起決定作用，表明乙烯利刺激對天然橡膠的主要合成途徑沒有直接促進作用。然而，Suwanmanee等［40］發現乙烯利刺激卻能夠顯著增加3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A合成酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A synthase，HMGS）的酶活性及mRNA的積累，HMGS能夠催化乙酰乙酸輔酶A 形成HMGR，在橡膠生物合成的早期階段起作用，可能為橡膠的生物合成提供原料，從而促進橡膠增產，這是乙烯利刺激能夠促進橡膠合成途徑相關酶基因表達的首次報道。此外，近年來研究發現MVA 途徑并非植物體內IPP合成的唯一途徑，借助于13C-標記的前體示蹤發現，通過2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸途徑（2-C-Methyl-D-Erythritol-4-Phosphate，MEP途徑）也能合成類異戊二烯的前體物質IPP［41］，表明天然橡膠的生物合成存在其他分支途徑。進一步研究證實MEP途徑受到乙烯利刺激的顯著影響，該途徑中許多基因的表達均受乙烯的誘導，如在橡膠樹膠乳中克隆到MEP途徑中2個關鍵酶基因4-二磷酸-2-C-甲基-D-赤蘚糖醇磷酸激酶（4-Diphosphocytidy l-2-C-methyl-D-ery thritol Kinase，CMK）和4-羥基-3-甲基 -2-（E）-丁烯基-4-磷酸還原酶（4-hydroxy-3-methyl-2-（E）-butenyl-4-diphosphate reductase，HDR）的表達都受到乙烯利的誘導［42，43］，且乙烯利能夠上調HbCMK和HbHDR基因的表達水平，暗示乙烯利刺激可以加速MEP途徑的代謝進程，推測乙烯利可能通過其他旁支途徑起相關生物學效應。

2.3.2 乙烯利促進排膠及其機制 橡膠樹的排膠是指乳管被割斷或受機械損傷后膠乳溢出的現象。其對膠乳產量的影響主要表現在膠乳的流速和延續時間兩方面，尤其是對膠乳流的延續時間對膠乳產量的影響最為顯著。割膠后隨著膠乳的外流，乳管割口處因膠乳絮凝而引起的乳管內堵塞的現象被稱為膠乳的停排。實踐證實乙烯利刺激割膠可以延緩乳管內堵塞現象，加速水分吸收，同時大量動員貯備養料，并集中于乳管系統，使排膠時間延長，膠乳產量增加［44］。

在排膠方面，關于乙烯利刺激橡膠樹增產的原因主要集中在以下3個方面：（1）提高膠乳中黃色體的穩定性，導致排膠時間延長，膠乳產量增加。該觀點認為由于割膠改變了乳管的滲透壓，引起膠乳中對滲透壓敏感的黃色體破裂，并釋放出對橡膠粒子有絮凝活性的陽離子，使得膠乳發生絮凝和凝固，從而堵塞割口影響排膠，而乙烯利刺激能降低膠乳中黃色體破裂指數，導致排膠時間延長，膠乳產量增加。如前人通過對乙烯利刺激前后橡膠樹膠乳進行等密度離心，結果發現乙烯利刺激前膠乳中黃色體主要分布在底層，多為破裂的或再凝集的黃色體；乙烯利刺激后膠乳中黃色體主要分布在中間層，大多數為完整無損的黃色體，而且與乙烯利刺激前相比，膠乳中黃色體破裂指數降低45%，堵塞指數降低31%［45］。（2）降低膠乳的絮凝活性。該觀點認為乙烯利刺激可能影響膠乳凝集有關基因的表達模式，從而延遲膠乳凝結過程，導致排膠時間延長，膠乳產量增加［46］。眾所周知，膠乳中含有凝固因子和抗凝固因子，這些因子之間的平衡對橡膠樹的產量至關重要。橡膠蛋白（hevein）作為膠乳凝固的主要凝固因子，是黃色體中可溶性蛋白的最主要構成成分，約占其總量的70%［19］。當黃色體破裂時，能夠釋放大量的橡膠蛋白進入乳管細胞液中，與橡膠粒子表面受體的糖蛋白結合形成多價橋，從而引起橡膠粒子凝絮和乳管原位堵塞。同時，膠乳中還含有高水平的抗凝固因子——幾丁質酶（hevamine），其中98%的幾丁質酶位于黃色體中，它們能夠競爭性的結合與凝結有關的橡膠蛋白受體位點，從而延遲膠乳凝結過程。如研究證實乙烯利刺激能夠顯著提高幾丁質酶的表達水平，從而延緩橡膠粒子之間的絮凝作用和膠乳的凝固過程［47］。此外，乙烯利刺激還能促進活性氧（activated oxygen species，AOS）的產生，使得過氧化物累積與活性氧清除失衡，黃色體破裂并釋放凝固因子，膠乳原位凝固，致使排膠停止。但研究發現乙烯利刺激卻能增加AOS清除相關酶類基因的轉錄水平，這些基因的表達與黃色體穩定性和膠乳絮凝密切相關。如Miao等［48］證明乙烯利處理后，橡膠樹中編碼錳超氧化物歧化酶（Mn-SOD）的兩種基因在膠乳細胞中過量表達，表明Mn-SOD在乙烯利刺激橡膠樹增產起著重要的調節作用。吳瑞等［49］研究證實乙烯利和過氧化氫處理均能誘導膠乳中金屬硫蛋白基因HbMT2的表達，體外實驗證實HbMTZ2具有清除活性氧自由基的功能，與黃色體的穩定和膠乳絮凝相關。（3）乙烯利刺激能擴大橡膠樹的排膠影響面，從而提高膠乳產量。如前人觀察到乙烯利刺激后橡膠樹的排膠影響面不僅限于割面，而且可使排膠影響面延伸至樹干2 m的高度［50］。Tungngoen等［51］發現施用乙烯利后，橡膠樹樹皮中水通道蛋白相關基因HbTIP1和HbPIP2的表達模式發生改變，使得乳管與周圍組織之間的水循環得以改善，排膠影響面擴大，膠乳產量增加。莊海燕等［52］研究表明乙烯利處理橡膠樹后，水通道蛋白基因HbPIP1 和 HbPIP2 的表達具有明顯的時效性，而且兩者的表達量在乙烯利處理 6 h后達到最高，與增加乳管膨壓和排膠影響面，協調橡膠樹韌皮部的水循環平衡密切相關。

2.3.3 乙烯信號轉導與乳管發育的關系及其作用機制 在橡膠樹中，乳管是由韌皮部的形成層細胞分化而來的多細胞管狀組織。由于橡膠樹的韌皮組織具有較大的膨壓，切割樹皮后膠乳排出。割膠和乙烯利刺激相當于某種程度的脅迫處理，能夠促進乳管中天然橡膠的合成。同時，研究表明機械損傷以及與割膠相關的滲透壓調節都能誘導橡膠樹中內源乙烯和茉莉酸的合成［18，53］。此外，機械損傷和外源茉莉酸處理還能促進幼齡橡膠樹莖稈樹皮中次生乳管細胞的分化［54，55］，表明乙烯和茉莉酸在乳管分化和膠乳代謝過程中都起著重要的調控作用。

在膠乳代謝相關基因的轉錄調控水平，諸多研究表明外源乙烯處理可以誘導乳管發育的多個生物學過程，諸如蔗糖卸載［56］、水分吸收［27］、營養同化或防御蛋白的合成［57］，該過程涉及大量ERF基因的表達［27，58］，表明乙烯利刺激橡膠樹增產與乙烯信號轉導通路相關基因的表達密切相關。在基因的轉錄水平與轉錄后調控水平，ERF不僅能夠激活或抑制下游一系列乙烯響應相關基因的表達，而且ERF還是多種信號通路的交叉控制節點［59］。在橡膠樹膠乳代謝和次生乳管發育中，ERF作為乙烯和茉莉酸信號通路的交叉調控節點，能將乙烯信號通路與茉莉酸信號通路整合在一起，協同調控乳管發育的多個生物學進程，該過程涉及大量的ERF基因的表達［60］。如研究證實ERF1作為乙烯和茉莉酸信號通路的轉錄激活位點，能夠調節橡膠樹體內大量乙烯和茉莉酸響應相關基因的表達［18］。因此，考慮到乙烯和茉莉酸在調控乳管發育中的關鍵性作用，ERF極有可能在橡膠樹乳管分化和形態學建成過程中起到信號轉導的橋梁作用。

2.3.4 miRNA與產排膠的關系及其作用機制 近年來，關于miRNA與激素響應因子間的互作研究取得了長足進展，這些研究結果表明植物的生長發育過程很大程度上受到miRNA與激素行為的相互調控。因此，洞悉橡膠樹響應乙烯利刺激相關miRNA及相關靶基因的種類，將有助于確定相關功能性miRNA及其靶基因在膠乳代謝、乳管發育及乙烯信號轉導中的重要性，為進一步深入揭示橡膠樹響應乙烯利刺激的分子機理奠定了良好基礎。

在膠乳代謝相關基因的轉錄后調控水平，諸多研究證實miRNA通過多種方式廣泛參與了膠乳代謝、乳管分化及乙烯信號轉導過程，它們是膠乳代謝過程中不可缺少的重要組成部分。如Gebelin等［61］對橡膠樹中響應不同激素處理與非生物學脅迫相關的miRNA進行鑒定，結果發現乙烯利處理后橡膠樹樹皮中hbr-miR396和hbr-miR319的表達量呈下調表達趨勢；而未用乙烯利處理橡膠樹樹皮中hbrmiR166和hbr-miR319的表達量卻呈高豐度表達，表明乙烯利處理后橡膠樹樹皮中miRNA的種類及其表達量呈現出不同的表達趨勢。Duan等［62］通過對橡膠樹中參與乙烯信號轉導相關的miRNA及其靶基因進行鑒定，研究結果表明包括hbr-miR156、hbrmiR159、hbr-miR172、hbr-miR393、hbr-miR395、hbrmiR396、hbr-miR408、hbr-miR894、hbr-miR1511、hbr-miRn11、hbr-miRn12及hbr-miRn14在內的12個miRNA與乙烯信號轉導密切相關，它們能夠分別抑制28個HbAP2/ERF基因的表達，且相關miRNA與靶基因的作用位點均位于AP2結構域的保守區域。其中8個miRNA家族（包括hbr-miR159、hbrmiR172、hbr-miR393、hbr-miR408、hbr-miR894、hbrmiRn11、hbr-miRn12和hbr-miRn14）能夠抑制30個膠乳代謝相關ERF基因的表達，暗示一些具有重要調控功能的miRNA廣泛參與了橡膠樹的乙烯信號轉導和膠乳代謝過程。Porawee等［63］通過對乙烯利敏感型橡膠樹高產無性系PB217中參與乙烯利響應相關miRNA的種類進行鑒定和功能分析，結果表明乙烯利處理橡膠樹后，樹皮中hbr-miR159和hbrmiR166的表達量呈顯著下調表達趨勢，相反hbrmiR167與hbr-miR172在樹皮中的表達量卻呈顯著上調表達趨勢。進一步對篩選到的乙烯利響應相關miRNA的靶基因進行鑒定，結果表明除hbr-miR159未能找到相應的靶基因外，hbr-miR166可以靶向HD-ZIPIII（亮氨酸拉鏈蛋白），hbr-miR167可以靶向ARF6/ARF8（生長素響應因子），hbr-miR172可以靶向REF3（橡膠延伸因子），這些靶基因中HDZIPIII被認為廣泛參與了植物中初生與次生維管組織的形態學建成［64］；ARF6/ARF8據報道在植物的維管發育中起重要調控作用［65］，而REF3與膠乳中大橡膠粒子的合成，以及橡膠分子鏈的延伸密切相關［66］，推測乙烯利處理橡膠樹后，樹皮中hbrmiR166/HD-ZIPIII、hbr-miR167/ARF6或ARF8及hbrmiR172/REF3的表達差異，可能導致了橡膠樹排膠時間延長及膠乳產量增加，在橡膠樹響應乙烯利刺激的生理機制中起重要調控作用。此外，該研究結果還推測橡膠樹幼嫩樹皮中hbr-miR172及其靶基因REF3的負調控關系，可能導致了乙烯利敏感型橡膠樹品系中膠乳產量的大量增加。同時，結果還暗示在長期的乙烯利處理中，hbr-miR167與ARF6/ARF6參與的乳管發育衰退，可能逐步導致了死皮綜合癥的發生。

綜上所述，前人研究表明乙烯利刺激橡膠樹的增產過程既與產膠有關，又與排膠有關，同時，也與乙烯信號轉導密切相關（表1）。目前，關于乙烯利刺激橡膠樹增產的觀點主要集中在以下幾個方面：（1）乙烯利刺激橡膠樹后能導致蔗糖轉運和代謝加速，由于蔗糖是橡膠生物合成的原料，因此認為乙烯利刺激橡膠樹后蔗糖代謝加速可能是乙烯利刺激橡膠樹增產的一個主要原因。（2）乙烯利刺激能夠顯著增加 HMGS 的酶活性及mRNA的積累，以催化乙酰乙酸輔酶A 形成HMGR，從而為橡膠的生物合成提供原料，促進橡膠增產。（3）雖然研究證實天然橡膠生物合成重要途徑相關基因的表達不受乙烯利的誘導，與乙烯利刺激橡膠樹增產沒有直接關系，但天然橡膠合成的其他分支途徑卻受乙烯利刺激的顯著調控，推測乙烯利刺激橡膠樹增產可能通過其他生物學合成通路產生相關生物學效應。（4）乙烯利刺激橡膠樹增產主要是通過加強排膠過程來實現的，其原因在于乙烯利刺激可能通過增加膠乳中黃色體的穩定性，從而延長排膠時間來實現膠乳產量的增加。（5）最新研究表明乙烯利刺激橡膠樹增產不僅與乙烯信號轉導通路相關基因的表達密切相關，而且一些具有重要調控功能的miRNA也廣泛參與了橡膠樹的乳管發育和膠乳代謝過程，它們是膠乳代謝過程中不可缺少的重要組成部分。

2.4 乙烯利刺激橡膠樹增產的假說

綜上所述，盡管前人已從膠乳代謝的生理生化水平、膠乳代謝相關基因的轉錄調控水平及轉錄后調控水平等角度分析了橡膠樹響應乙烯利刺激的調控機制，但關于橡膠樹響應乙烯利刺激的分子機制仍不明確。

目前，關于乙烯利刺激橡膠樹增產機制主要有以下3種假說：（1）解除乳管堵塞假說［67］，該假說認為膠乳細胞中富含對滲透性敏感的黃色體，由于在排膠過程中膠乳發生稀釋反應，導致滲透壓降低，黃色體破損，并釋放出二價金屬離子等致凝物質，使得膠乳產生絮凝作用，引起乳管原位堵塞。而乙烯利刺激能夠提高膠乳細胞中黃色體的穩定性，降低乳管的堵塞指數，延長排膠時間，從而產生增產效應。（2）誘導愈傷反應假說［68］，該假說認為與其他植物一樣，橡膠樹在受到傷害（如機械傷害割膠或化學傷害乙烯利刺激）之后，便會產生大量的內源創傷乙烯或應激誘導乙烯，這種乙烯可作為大幅度動員貯備物質的化學信號向周圍組織傳遞，引起愈傷反應［69］，促使水分和養分向愈傷部位運輸，從而增強膠乳再生機能和強化乳管系統的排膠作用，使得膠乳產量明顯增多，形成一個大幅度增產高峰。隨后因原料迅速消耗，膠乳產量又逐漸回落。（3）解除基因表達阻遏假說，該假說認為乙烯利刺激后，不僅能提高原生質膜上ATP酶的活性，使得激活的ATP酶能與蔗糖結合形成H+-蔗糖共運轉，為蔗糖進入乳管的主動運輸過程提供所需的能量和驅動力［70］。同時，負責液泡膜質子ATP酶合成的基因在乙烯利的作用下，處于去遏制狀態，促使質子運輸激活，質子流入黃色體，并誘使檸檬酸和Ca2+進入液泡，使得細胞液堿化，轉化酶活性提高，加速蔗糖降解，最后促使異戊二烯的合成作用激活、加快。該假說把乙烯利刺激增產歸因于釋放出的乙烯解除了 H+-ATP酶合成基因的阻遏狀態，從而刺激了乳管中橡膠的生物合成。目前，以上3種假說都僅能解釋乙烯利刺激后橡膠樹產膠和排膠過程中的部分生理現象，仍缺乏相應的分子生物學實驗證據，關于乙烯刺激橡膠樹增產的機理還缺乏統一的定論。此外，關于ERF基因在天然橡膠生物合成中直接作用方式仍存在很大爭議，需要進一步加強相關研究。

表1 已證實巴西橡膠樹中參與乙烯響應相關基因與miRNA的種類及功能

3 乙烯利刺激對橡膠樹的副作用

與任何事物存在兩面性一樣，乙烯利使用得當，可顯著提高膠乳產量，挖掘橡膠樹的產膠潛力，但使用不當將使乙烯“利”轉而成為乙烯“害”，導致橡膠樹發生排膠線變窄、排膠線內縮、樹皮發生肥腫、韌皮部壞死、傷口不易愈合、死皮等不良反應［71-73］。目前，生產中高強度割膠與過度乙烯利刺激盛行，對天然橡膠生產造成的危害與副作用已日益明顯［74］，其危害與副作用主要體現在以下幾個方面：（1）高頻率或高濃度的乙烯利刺激使得橡膠樹死皮病的發生機率加大。研究表明當乙烯利刺激濃度達10%以上時，橡膠樹會出現過度長流、割面暴皮流膠、割線變褐、死皮增多等現象［75］。（2）長期施用乙烯利刺激導致橡膠樹養分和水分流失嚴重，橡膠樹生長緩慢。前人研究表明乙烯利刺激主要通過延長排膠時間來增加膠乳產量，在排膠時間延長的同時，橡膠樹的養分流失量要比產量增加量大1-3倍，而且乙烯利刺激割膠后橡膠樹養分流失成分不同于常規割膠，其中隨膠乳流失的磷鉀比例較高［76］。其次，由于乙烯利刺激后膠乳強烈稀釋，導致橡膠樹在較短時間內流失大量水分，尤其在干旱季節乙烯利刺激割膠帶來的水分虧缺問題則更為突出。前人研究證實乙烯利刺激割膠帶來的養分和水分的大量消耗，甚至能引起包括砧木在內整株橡膠樹生長小環境的變化［77］，嚴重影響橡膠樹的正常生長。（3）長期施用乙烯利容易導致割線附近樹皮的衰老。長期施用乙烯利后，橡膠樹割線附近水囊皮會遭受不同程度的破壞，致使水囊皮變薄、水囊皮中石細胞數量增多，進而對形成層造成傷害［78］。（4）長期施用乙烯利能導致乳管細胞中活性氧代謝的失活。研究表明長期施用乙烯利刺激能增加橡膠樹乳管細胞中NAD（P）H氧化酶活性，進而產生大量的活性氧成分，使乳管細胞中活性氧的產生與清除機制失去平衡［79］，從而使膠乳細胞中黃色體破裂，膠乳原位凝固，乳管細胞喪失產膠功能。

總之，前人研究結果表明，在天然橡膠生產中，只有在貫徹管養割相結合的前提下，根據橡膠樹的品系特性，采取低頻、短線、少藥、淺割、增肥及產膠動態分析等保護性措施和膠乳生理參數綜合調控手段［80，81］，合理控制乙烯利的刺激濃度與割膠強度，使橡膠樹的生產與產膠、產膠與排膠保持動態生理平衡，才能使橡膠樹安全生產和持續高產及穩產。

4 展望

正確認識乙烯利對橡膠樹增產的調控機制及副作用具有十分重要的實踐指導意義，它不僅是降低乙烯副作用傷害，保證天然橡膠可持續發展的前提，而且也是合理指導乙烯利刺激技術，開展乙烯利精準施藥，以及研制高效、低傷害的新型乙烯利刺激劑的基礎。盡管前人已對橡膠樹響應乙烯利刺激的生理效應進行了多角度分析，但迄今，關于乙烯利刺激橡膠樹增產的分子調控機制仍然未知。

縱觀近年來橡膠樹響應乙烯利刺激的相關報道，與生理生化方面已取得的研究進展相比，橡膠樹響應乙烯利刺激的分子調控機制研究相對滯后，有關乙烯利刺激橡膠樹增產的一些問題仍需進一步深入探討。如（1）乙烯利在橡膠樹增產分子機制中所扮演的真正角色問題。（2）乙烯利刺激使得橡膠樹的糖酵解產物偏離橡膠烴的合成途徑，從而降低蔗糖轉化為橡膠烴的效率，不利于橡膠的生物合成和橡膠質量的提高問題。（3）不同濃度乙烯利對橡膠樹活性氧產生速率及抗氧化保護酶系統的影響不同，以及相關濃度乙烯利刺激后，橡膠樹乳管細胞中活性氧的產生與清除的平衡問題。（4）乙烯利刺激后，乳管細胞中一些重要的細胞器、蛋白質或者基因等產生復雜變化后對膠乳代謝的影響問題。（5）不同橡膠樹品系，以及不同割齡橡膠樹都表現出不同的耐乙烯利刺激特性，其生理生化參數也存在一定差異。如何采用合適的乙烯利刺激濃度和方式問題，這些問題仍是研究橡膠樹的乙烯生理學及乙烯利刺激增產機制的重要課題之一。

此外，考慮到乙烯利刺激割膠已成為現在割膠制度的重要組成部分，生產中耐乙烯利刺激橡膠樹品系的匱乏，已成為天然橡膠產業可持續的重要限制因素，亟需進一步深入探究橡膠樹響應乙烯利刺激的分子調控機制，為選育橡膠樹高產、耐乙烯利刺激新品種選育提供理論依據。為此，筆者認為今后還應進一步加大以下幾個方面的研究力度：（1）目前，雖然已從橡膠樹中克隆出大量的乙烯響應相關基因，但由于橡膠樹遺傳轉化體系尚不完善，相關基因的功能鑒定還有一定的困難，下一步應繼續加強橡膠樹遺傳轉化方面的研究力度，加強技術攻關，在橡膠樹再生體系以及穩定遺傳轉化體系的建立等方面做好技術儲備。（2）鑒于乙烯利刺激橡膠樹增產機制的復雜性，該過程受轉錄水平和轉錄后水平多重調控，急需借助于新一代測序技術對橡膠樹乙烯響應相關基因和非編碼RNA進行大規模篩選，從乳管分化、產膠、排膠及膠乳再生等角度對橡膠樹響應乙烯利刺激相關基因和miRNA進行系統的分類、鑒定和功能驗證，從整體水平解析乙烯利刺激橡膠樹增產機制的本質。此外，鑒于乙烯利刺激后，磷酸化作用，糖基化作用、異戊烯基化、膠乳生理參數pH、離子平衡及ATP的變化等都在橡膠樹膠乳合成調控中起重要作用，且相關的報道和研究數據較少，需加強相關方面的研究力度。

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（責任編輯 狄艷紅）

Research Progress of the Physiological and Molecular Regulation Mechanism of Hevea brasiliensis in Response to Ethephon Stimulation

WEI Ming-ming LI Wei-guo GAO Xin-sheng HUANG Xiao
（State Centre for Rubber Breeding，Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree of Ministry of Agriculture，Rubber Research Institute，CATAS，Danzhou 571737）

Application of the ethephon stimulation，as an important means to increase the yield of rubber tree， has been widely used in the production of natural rubber. However， the regulatory mechanism of rubber tree in response to ethephon stimulation is still unclear， which has become one of problems that need to be solved urgently in developing the new rubber tree stimulation agent and breeding new rubber tree varieties with ethephon stimulation resistance. This paper summarized such researches in recent years，the genes related to the ethylene signal transduction pathway of rubber tree，the biological regulation mechanism of rubber tree in response to ethephon stimulation，and the side effects of ethephon stimulation to rubber tree， aiming to provide

for deeply studying the molecular mechanism of the rubber tree in res ponse to ethephon stimulation.

Hevea brasiliensis；ethephon；regulation mechanism

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.002

2015-04-14

國家天然橡膠產業技術體系（CARS-34），農業部基本科研業務費（1630022013001）

位明明，男，博士，研究方向：橡膠樹遺傳育種；E-mail：rekeyuanlywmm@126.com