抗菌肽高效表達及生產優化研究進展

楊平袁奕豪楊曉莉鐘玥廖于鑫高榮

（1. 四川大學生命科學學院，成都 610064；2. 四川大學高分子科學與工程學院，成都 610064）

抗菌肽高效表達及生產優化研究進展

楊平1袁奕豪2楊曉莉1鐘玥1廖于鑫2高榮1

（1. 四川大學生命科學學院，成都 610064；2. 四川大學高分子科學與工程學院，成都 610064）

抗菌肽是基因編碼、經外界誘導產生的一類多肽。在抗生素引發“耐藥性”難題的時代，抗菌肽以廣譜殺菌、不易產生耐藥性、抗腫瘤、抗病毒等特點而擁有超越抗生素、造福人類的巨大潛能。然而，天然抗菌肽還需進行增強抗菌性和穩定性、降低細胞毒性等改造，并通過工業化改良實現大規模生產。因此現從抗菌肽改造設計、生產應用等最新研究做較為詳細的綜述。

抗菌肽；分子設計；表達策略；生產優化

抗菌肽因其擁有的廣譜抗菌、不易產生耐藥性、調節先天免疫等諸多優點而備受關注。目前市場上已有抗菌肽產品，并且市場效果良好。但是天然的抗菌肽仍然存在許多不足，如天然含量少、生產成本高、毒副作用大和工藝條件復雜等。因此其作為具潛力的生物制品之一，自發現以來被不斷改造以改善抑菌活性、表達產量及溶血性等特性［1-4］。抗菌肽的優化改進一直是研發階段的主要任務，也是決定整個生產的重要因素。而迄今為止，研究者對抗菌肽生產及應用過程中的改進也做了相應探討。

1 研發設計

研發階段可從根本上解決抗菌肽產量不高、溶血性和抗原性等問題，提高廣譜抑菌性和表達產量。通過不斷研發，人們在抗菌肽分子的設計、表達載體和表達系統的優化與選擇、計算機模擬預測等方面取得了一些可喜成果。現逐一闡述如下。

1.1 抗菌肽分子設計

1.1.1 氨基酸組成與序列改變 抗菌肽的抑菌、抗癌及增強天然免疫等優點主要因為它的螺旋結構、兩親性、陽離子等特點。目前許多分子設計都是針對其氨基酸組成與序列進行改造。這類改造主要有兩種，一是不改變氨基酸的種類而改變其順序；二是對氨基酸的種類進行增減從而賦予其新性能。突變可導致氨基酸殘基的移碼、替換、插入或者刪減等，是抗菌肽結構功能研究中的常用方法。抗菌肽經過改造修飾后能有顯著優勢變化，如抗菌活性提高、溶血性降低、抗癌能力增強、高表達量等。明飛平等［5］通過PCR敲除抗菌肽PR39的5'UTR多余核苷酸得到重組質粒，再構建已刪除8個核苷酸的新型表達載體pPIC9K-PR39-D-E，產生的抗菌肽具有高表達量和抑菌活性。劉忠淵等［6］將cecropin-XJ的C末端賴氨酸突變成天冬酰胺，抑菌試驗檢測發現后者抑菌活性高很多。它們的電荷數相同、螺旋度與疏水性相似，在此情況下二者的抑菌活力不同，推測應該是由于天冬酰胺導致的結果。

1.1.2 去除多余結構并保留修飾活性部分 天然抗菌肽中不都是保證其活性的必需成分，而較大的肽鏈和蛋白質分子會對抗菌肽的穩定性、免疫原性等產生影響。因此，去除其多余結構、保持活性部分是重要改良措施之一。van Dijk等［7］將cathelicidin-2截短后，溶血性和毒性均得到明顯改善。Jittikoon等［8］對Cc-CATH3的氨基酸殘基進行研究發現，其N端的前4個氨基酸殘基對執行抗菌肽的功能沒有任何影響，而第5-8個殘基則對抗菌肽活性起到至關重要的作用。

1.1.3 抗菌肽形態設計 不同形狀抗菌肽的抑菌效果、穩定性等不同。于嵐嵐等［9］合成線性、環狀、短鏈多肽發現，其與細菌細胞膜結合能力及殺菌活性順序均為長鏈肽＞環狀肽＞短鏈肽。穩定性是環狀肽＞長鏈肽＞短鏈肽。而穩定性往往決定其大規模生產的可能性，因此環狀肽對提高抗菌肽產品穩定性具有重要作用。超短肽也具有其特性，大部分抗菌肽可與細胞膜相互作用，而超短肽易將疏水性和正電性共同體現出來，所以抗菌抗病毒能力很強。另外，超短肽分子量較小，所以較易表達。Ahn等［10］用修飾后的組氨酸合成的超短擬肽具有較高抗菌活性，且對蛋白酶及鹽均有較高穩定性。

1.1.4 抗菌肽的協同作用 抗菌肽具有殺菌抗病毒的強大功能，而這不僅和其自身的性能機制有關，也受其他物質的影響、調控，這些因素包括多種抗菌肽基因共表達、抗菌肽與抗生素共作用、抗菌肽基因與其他基因相互作用等。天蠶素抗菌肽B在大腸桿菌中的表達是高度有害的，但是Yu等［11］將一種天蠶素抗菌肽B突變體和綠色熒光蛋白融合在大腸桿菌中表達并制備其抗血清，最后得到的融合肽特異性抗血清效價大于1∶25 600。Wang等［12］通過實驗探究發現抗菌肽PMAP-36和PRW4與抗生素gentamicin之間對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均存在協同作用，這對臨床藥物的開發都有著重要意義。

1.2 表達系統的優化與選擇

常用的表達系統分為3類：原核表達系統、真核表達系統、桿狀病毒表達系統。這3種表達系統各有特點，因此在表達不同抗菌肽時可根據抗菌肽性質與特點選擇適當表達系統并對其改造修飾。

1.2.1 原核表達系統 此類常用的是大腸桿菌表達系統，其具有培養簡單、繁殖迅速等特點，易進行工業化生產。許多真核基因如胰島素基因都可在大腸桿菌中實現高效表達，但其仍有不具備真核生物蛋白加工系統、表達量有限等缺陷。對此，不少針對包涵體、雜合肽等內容的研究工作正在展開以使大腸桿菌表達系統不斷優化。Wu等［13］研究的雜合蜂毒肽（1-13）-LL37（17-30）（M-L）是將蜂毒肽疏水性N末端（M）與抗菌肽LL37的核心片段（L）相連接，導入E.coli BL21中，在IPTG誘導下獲得約165 mg高表達量的融合蛋白。隨著DNA重組技術的發展，尤其這一發現——金黃色葡萄球菌帶有抗性標志的質粒可作為枯草芽孢桿菌載體，為克服枯草芽孢桿菌只有隱秘性質粒的困難奠定了重要基礎，使得枯草芽孢桿菌基因工程的研究迅速發展。迄今為止，枯草芽孢桿菌已成為最常用的原核表達系統之一，大量的原核和真核基因在枯草芽孢桿菌及其近緣種中得到克隆和表達，有的已應用于工業化生產，取得了不少成果［14-17］。Zobel等［14］在枯草芽孢桿菌中第一個表達編碼小分子環狀肽形成的真核生物的非核糖體肽合成酶基因，從而證明了枯草芽孢桿菌是適合異源表達真核非核糖體合成蛋白的重要表達系統。

1.2.2 真核表達系統 此類常用酵母表達系統，動植物細胞較其而言，培養條件復雜、生長較慢，并不宜大規模生產。目前動植物在抗菌肽的生產表達上主要有微藻表達系統和其他轉基因動植物。微藻表達系統具有低成本、少污染、可再生、大生物量等特性，因此其是繼大腸桿菌和酵母菌表達系統之后較有前景的表達平臺。Chen等［18］將兔防御素NP-l基因轉入小球藻，并且建立了高效的單細胞真核藻類表達系統進行表達。他們通過體外離體抑菌試驗證明，NP-1基因已穩定整合到小球藻基因組中，并進行了正確轉錄和表達。此外，Niu等［19］用Phaeodactylum tricornutum的硝酸還原酶的啟動子和終止子來優化Chlorella vulgaris，并以氯霉素乙酰轉移酶（chloramphenic awtyltransferase，CAT）作為報告基因構建好載體后，用電穿孔方法轉入小球藻中，最后發現轉基因小球藻不僅能夠在選擇性培養基上生長，而且具有很高的CAT表達量。目前的實驗來看，通過抗菌肽轉基因改造的動植物能抗蟲抗菌且穩定性強。Zeitler等［20］設計了幾種抗菌肽將其插入病毒載體中，再將重組子導入煙草內，結果得到0.025 mg（肽）/ g（受感染葉生物量），且轉基因煙草具有較好的生物活性。Li等［21］將CFG、抗菌肽Cecropin基因5'和3'端的片段等融合在同一載體上并將其轉入蠶體內，得到了具有抗菌效果的轉基因蠶繭。由此可見，轉抗菌肽基因動植物不僅對抗菌肽和轉基因的基礎研究有著重要意義，而且也將使煙草、絲綢等行業具有巨大的商業潛力。

酵母表達系統有很多優勢，如表達調控機理較清楚、可修飾真核生物蛋白質、易大規模發酵等。常用的酵母表達系統有釀酒酵母和畢赤酵母。釀酒酵母的生理過程會導致自身生長受限，從而降低了目的蛋白的產量，所以其在大規模生產中使用較少。目前最常用的是以甲醇為唯一碳源的畢赤酵母。其具有好氧生長和表達量高等特點，所以培養成本相對較低，可以支持高密度細胞培養。金小寶等［22］將分泌型重組表達質粒pPIc9K/Defen8in線性化后轉入巴斯德畢赤酵母GSll5中，并用0.5%的甲醇在28℃條件下誘導。結果顯示抗茵肽Defensin在畢赤酵母中得到了成功表達，且表達產物對大腸桿菌E. coli K12D31的生長有抑制作用。隨著發酵方法的建立，畢赤酵母以其獨特優勢和潛力被廣泛應用，但仍有不足的地方，如甲醇的去除和過糖基化等。如今科研工作者仍在不斷研究，以使畢赤酵母更適用于大規模工業化生產。

1.2.3 桿狀病毒表達系統 桿狀病毒表達系統適用范圍廣且表達效率高。常用的Bac-To-Bac系統具有周期較短、易純化、能大量重組等優點。Li等［23］將EG I基因轉入到 Bac-to-Bac/BmNPV突變表達體系中發現，所得的蛋白活性和家蠶細胞中表達的蛋白相比提高了22.71%，與被未突變的Bac-to-Bac病毒侵染后的家蠶細胞中的蛋白相比提高了24.71%。與真原核表達系統相比，桿狀病毒表達系統操作相對簡便，昆蟲細胞較易培養且成本低，外源基因表達量高，具有蛋白翻譯后修飾功能。然而桿狀病毒表達系統也具有一定缺陷。例如，雖然其糖基化位點與哺乳動物細胞一樣，但寡糖鏈性質有所不同，無法產生復雜糖基側鏈。因此在使用桿狀病毒載體表達某些抗原時，無法保持其天然狀態。另外用該系統表達的抗菌肽種類較少，這也可能與桿狀病毒宿主范圍狹窄有關。

1.3 表達載體的優化與選擇

抗菌肽常用的表達載體有大腸桿菌表達載體、酵母表達載體以及兩者都適合的穿梭表達載體等，優勢各異。其主要的改造研究如下。

1.3.1 宿主菌偏好型密碼子 有時人們使用的載體不一定完全適合表達系統。如人的載體在大腸桿菌中表達，就可能因宿主細胞對密碼子偏好性不同而導致蛋白表達產量不佳。若構建表達載體時使用宿主菌偏好型密碼子，便可使載體有效表達出抗菌肽。Ren等［24］根據已知的抗菌肽基因SMAP-29的氨基酸序列，參照畢赤酵母密碼子偏好性，設計并合成SMAP-29的成熟基因片段，且在誘導表達的第2天檢測到了預期的SMAP-29，并對金黃色葡萄球菌和白色念球菌都有明顯的抑菌效果。

1.3.2 不需要酶切的表達載體 以往在構建融合肽或雜合肽時需對產物進行酶切，使抗菌肽得到純化富集，但這些過程會對抗菌肽結構性質產生不良影響，使產物產量和質量受到損害。近年來，出現了一些不需酶切就可使抗菌肽表達后自身進行剪切或者剪接的載體。利用intein融合表達抗菌肽只需親和層析及在柱切割，操作簡便，成本低廉。謝永剛［25］構建OG2-intein2-CBD融合蛋白重組子，并且通過條件優化如降低誘導溫度及誘導劑IPTG濃度，有效提高蛋白的可溶表達。2A自剪輯技術的應用可將多個抗菌肽融合表達，然后經過自身剪輯使其各自行使功能，有利于抗菌肽協同表達和作用［26-28］。

1.3.3 5'非翻譯區序列改建 5'UTR對蛋白表達的影響主要表現在mRNA翻譯水平上。如在巴氏德畢赤酵母中表達時，mRNA 5'非翻譯區序列應與畢赤酵母AOXImRNA 5'非翻譯區序列一致。Staley等［29］研究發現AOX 1的5' UTR中存在著復雜的正面和負面的順式作用元件，其活性作用不僅僅與其長度有關，更與其改變的位置有關。明飛平等［5］在實驗中將抗菌肽重組表達質粒經PCR敲除5'端多余核苷酸序列后再經PCR、酶切構建5' UTR已刪除8個核苷酸的新型畢赤酵母表達載體，使兩者mRNA 5'非翻譯區序列相同，從而提高了抗菌肽PR39在畢赤酵母中的表達及其抑菌活性。

1.4 計算機模擬預測

隨著計算機技術飛速發展，很多軟件和計算機方法運用于科學研究和生產實踐。越來越多的生物工作者采用計算機方法減輕工作量。

目前，其在兩大方面對抗菌肽的工作有指導作用：一是其豐富而信息量宏大的數據庫；二是各種軟件技術的使用。一些常用的數據庫，如表1所示。

表1 各類抗菌肽主要數據庫

其能提供氨基酸組成、空間結構等信息，對科研工作有很大的指導作用。各種軟件技術（如ProtParam、NNPREDICT等）的發展，利于人們對抗菌肽合成、結構等進行較合理的預測。Lata等［30］新研發了AntiBP2，旨在為快速增長的抗菌肽研究領域提供一個有效、快速而方便的分類和設計預測方法。Avram等［31］用計算機軟件計算黃蜂毒素衍生物的疏水性、氫鍵等參數，建立了3D-QSAR模型并合成新的衍生物，部分衍生物比母體具有更好的抗菌活性。于嵐嵐等［9］在實驗中將新型抗茵肽的設計、活性研究及與磷脂相互作用與計算模擬相結合，得到有較強抑菌活性的抗菌肽。抗菌肽的選擇性和抗菌活性受到多種因素影響，可用計算機輔助手段分析，對抗菌肽進行修飾改造，得到大量結構全新的抗菌肽，并得出合理的使用方法和趨勢，設計出有高選擇性、高抗菌活性、低溶血性的抗菌肽，為化學和基因工程方法合成抗菌肽提供參考。

2 生產應用

抗菌肽經過幾十年的研究發展，已有很多成品出現在市場上，給生產生活帶來新的變化與發展。而將抗菌肽從上游研發階段帶入市場的關鍵就是發酵生產和分離純化及檢測過程。Li等［16］從物理參數和金屬無機鹽兩方面探索了提高枯草芽孢桿菌BS501a拮抗代謝反應發酵的優化條件。他們通過單因素輪換和正交實驗得到了發酵最佳物理參數應是初始pH為7.0，培養溫度30℃和發酵時間48 h，并探索出在金屬無機鹽中硫酸鎂、硫酸錳（尤其是硫酸鎂）對發酵起著重要的影響。由此可見，一個完整的發酵過程受到很多方面的影響，而要在諸多因素中選出合適的條件，通常難以通過完整的發酵過程進行探索或驗證。因此，必須借助計算機軟件和數學模型對重要參數進行預測，比較優化選擇。其一般步驟，見圖1。

圖1 發酵過程優化選擇步驟

發酵方式主有固體發酵和液體發酵。液體發酵的主要特點是能夠實現高密度發酵、機械化程度高。固體發酵主要是在低濕含量的固態培養基上（aw一般為0.4-0.90），在不腐爛和自然狀態下進行的發酵過程。其主要有設備簡單、操作簡便、原料來源廣等特點。選用不同的發酵方式對最終的發酵結果有很大影響。Zhu等［32］通過傅里葉變換紅外光譜、光學成像技術、高效液相色譜等技術分析了Bacillus amyloliquefaciens XZ-173在固態發酵和液體發酵兩種方式下發酵的脂肽組成、性質以及這兩種條件下的轉錄水平差異。他們最終發現在這兩種發酵方式下，脂肽的極性和結構沒有太多差異，但是液態發酵有較高的氨基酸比例以及較好的乳化和拮抗活性。在固體發酵條件下，脂肽的合成基因srfAA和sfp有較高積累，并且ituD和lpa-14的轉錄水平在很長一段時間內不斷升高。由此可見，固體發酵和液態發酵各自有其獨特的優勢，需要根據實際生產的需求不斷探索，選擇合適的發酵方式。

除了借助計算機軟件和發酵方式外，菌的培養發酵設備也是值得改進的重要內容。陶德錄等［33］報告了一套在上海實施了生產量達2 000 t/年抗菌肽的新技術、新工藝和新設備，為抗菌肽的規模化生產探索了一條新途徑。李建華等［34］設計了一種新型的帶有上下翻蓋的托盤平動固態發酵機，他利用Matlab對發酵罐內托盤的3種排列方式下的各種情況進行了基于托盤運動不干涉的各機構參數的初步求解和精確求解，對噴霧接種時生物顆粒流體系統的兩相流進行了分析，并采用 CFD 計算流體動力學軟件仿真和實驗驗證的方法對噴頭類型、噴霧參數等因素對噴霧接種效果的影響進行了系統的研究。最后實驗和仿真結果表明，用噴霧接種實現純種固態發酵過程的自動化、保證接種的均勻性是可行的，渦流扇形霧噴頭 TT1102 在噴霧壓力為 0.3 MPa 時的能量耗散率最低、菌種死亡率最小。這種設備通過發酵過程的自動控制，創造良好的生產條件，保證真正意義的純種固態培養，可以得到生長好且質量均勻的產品，同時又便于工業規模的放大。

中游發酵完成之后，下游的分離純化、包裝檢測等目前都是一些較為常規的技術，比如產品濃縮時，工業生產上多采用旋轉蒸發、噴霧干燥、冷凍濃縮等方法將產品制成結晶、干粉等形式，便于產品保存和后期檢驗及再加工等操作。鑒定是否為目的抗菌肽常用方法有質譜分析、電泳、PCR等，對產品抑菌性質進行檢測常用的方法是瓊脂孔穴擴散法。當然，在產品形式設計與包裝中也應該體現出科學性。現在生產生活中已有多種形式的抗菌肽制劑，如粉制劑、噴霧制劑、凝膠制劑等。這些形式都是根據公司產品特點和市場適應性設計包裝的。而抗菌肽在應用時也應該探索合適的條件，注意一些影響因素。如Terova等［35］在研究中指出內源性抗菌多肽能直接快速殺滅病原體，但其mRNA的表達量受到急性脅迫壓力的調控影響。這一發現將對魚類的健康和成功養殖有著重大意義。Wang 等［36］通過實驗發現帶鋅甲硫氨酸和抗菌肽具有協同作用，能夠更好提高斷齡豬仔的免疫力、提高生長性能。Nithya等［37］發現用來自Bacillus licheniformis Me1的部分純化抗菌肽與LDPE和纖維素材料制成活性薄膜，其在食物的抗菌保鮮方面可有重要作用。

3 展望

在這個亟需倡導綠色環保的時代，抗生素的使用已經無法滿足人們對更高質量生產生活的追求。抗菌肽應時而生，自被人類發現以來展現出來其獨特的眾多優勢和潛力，作為抗生素的替代者而備受期待。在這30多年的發展中，抗菌肽的研發和生產取得了很大進步，已經能夠通過工業生產出良好的商品進入人們生產生活的方方面面，如美容行業、飼料行業、醫藥業及食品添加劑等等。其中抗菌肽又在飼料行業應用頗多，只是其作為飼料在實際應用中也面臨著許多的問題，如如何不影響動物的食欲、提高其免疫力、增強肉質等。而且如何大規模地生產優化的抗菌肽使其滿足人們的生產生活也是一大難題。但隨著科技的不斷發展、經驗的不斷增加，人們對抗菌肽的分子改造和生產研發將有著越來越多的認識和改進，抗菌肽的大規模工業化生產也會日益成熟，而這將是“后抗生素時代”的一條全新出路。

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（責任編輯 狄艷紅）

Research Progress of Efficient Expression and Optimization of Production of Antibacterial Peptide

YANG Ping1YUAN Yi-hao2YANG Xiao-li1ZHONG Yue2LIAO Yu-xin2GAO Rong1
（1. College of Life Science，Sichuan University，Chengdu 610064；2. College of Polymer Science and Engineering，Sichuan University，Chengdu 610064）

Antimicrobial peptides（AMPs），a class of polypeptides induced by external conditions，are encoded by specific genes. In the era of facing the issue of “drug resistance” caused by antibiotics，AMPs own huge potential of benefits to mankind and replacing the antibiotics due to their characteristics of broad-spectrum antibacterial activity，scarce generation of drug-resistance，and antitumor virus，etc. However，the antibacterial activity and instability of natural AMPs should be enhanced，their toxicity should be reduced，and the large-scale production may be achieved by improving the industrial process. Therefore，the recent researches on the molecular modification and design，production and application of AMPS are summarized in detailed here.

antimicrobial peptides；molecular design；expression strategies；production optimization

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.005

2015-06-11

國家自然科學基金項目（30871855），科技部國際科技合作項目（2011DFA10101103），四川大學大學生創新基金資助（208240-4184011，2020404131001）

楊平，女，研究方向：分子免疫、生物技術；E-mail：523008626@qq.com

高榮，教授，研究方向：分子遺傳和基因工程、分子免疫學、生物技術、微生物學和動物傳染病等；E-mail：gaorong96@163.com