microRNA-483和microRNA-486在克隆和轉fat-1基因牛組織中的表達

呂洋王煜，2孫佳佳弓春玲李光鵬

（1. 內蒙古大學實驗動物研究中心，呼和浩特 010070；2. 內蒙古醫科大學附屬醫院，呼和浩特 010050）

microRNA-483和microRNA-486在克隆和轉fat-1基因牛組織中的表達

呂洋1王煜1，2孫佳佳1弓春玲1李光鵬1

（1. 內蒙古大學實驗動物研究中心，呼和浩特 010070；2. 內蒙古醫科大學附屬醫院，呼和浩特 010050）

利用熒光定量PCR比較正常受精牛、克隆牛和轉基因牛的心、肝、脾、肺、腎、胎盤、子葉、子宮內膜中miR-483和miR-486的表達水平。結果顯示，miR-483和miR-486在正常受精牛、克隆牛和轉fat-1基因牛的組織中均有表達，其中在心臟中表達量顯著高于其他組織。而轉fat-1基因牛心臟中miR-483和miR-486表達量均低于正常牛。miR-483和miR-486在不同組織中表達量存在一定差異，在心臟中呈現高表達，提示miR-483和miR-486表達降低可能與心肌肥大、心肌梗死等病理生理過程有關。

miR-483；miR-486；轉基因牛；心臟

miRNA表達分析和功能探索在轉基因生物領域中已成為熱點問題。microRNA（miRNA）是一類內源性的21-25 nt大小的單鏈非編碼小分子RNA，在生物體內廣泛存在，能夠在轉錄后水平調控基因的表達，與機體的生長、發育、繁殖、疾病等活動相關［1］。miRNA在不改變基因結構的基礎上影響基因的表達，成為表觀遺傳學的重要組成部分。目前對于miRNA 在生殖發育中的研究已逐步展開，包括對miRNA 高通量分析，特異性的組織或細胞中特定 miRNA 的表達、調控靶基因和功能研究［2］。fat-1基因來源于秀麗線蟲（Caenorhabditis elegans，C. elegans），又名ω-3多聚不飽和脂肪酸脫氫酶基因。其產物ω-3多聚不飽和脂肪酸脫氫酶以ω-6多聚不飽和脂肪酸（Omega-6 polyunsaturated fatty acids，ω-6 PUFAs）為底物，將其脫氫轉化為ω-3多聚不飽和脂肪酸（Omega-3 polyunsaturated fatty acids，ω-3 PUFAs）［3］，ω-3 PUFAs作為重要生物活性物質，對人體健康尤其在預防和治療心腦血管、癌癥等多種疾病方面有著重要作用。增加膳食中ω-3 PUFAs的含量，能夠顯著減少冠心病發病率與死亡率，并且能延緩動脈粥樣硬化進展［4］。本研究利用熒光定量PCR分析轉fat-1魯西黃牛、克隆牛和正常受精牛主要器官組織中miR-483和miR-486的表達情況，旨在探討miR-483和miR-486可能的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

轉fat-1基因魯西黃牛的制備：構建fat-1基因pST200表達載體，轉染牛胎兒成纖維細胞，G418篩選后挑選轉基因單克隆，核移植獲得供體細胞，得到轉基因克隆胚胎，通過胚胎移植到代孕魯西黃牛體內，出生后經鑒定為轉fat-1基因牛。采集3例正常受精、2例克隆、2例轉基因魯西黃牛心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胎盤、子葉、子宮內膜組織，迅速放入液氮保存。動物實驗經內蒙古大學動物實驗倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 各組織總RNA的提取 將組織從-80℃取出后，用RNAiso for small RNA kit（TaKaRa）提取組織RNA，取2 μL在1%瓊脂糖凝膠電泳上檢測總RNA的質量并利用Nanodrop測量濃度并測定總RNA的A260/A280的值在1.8-2.1之間。

1.2.2 合成cDNA 利用Primer 5.0引物設計軟件分別根據miRBase提供的miR-483和miR-486，以及內參U6的序列設計microRNA定量引物（表1），根據One Step PrimeScript? miRNA cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）反轉錄試劑盒說明書合成cDNA。反應結束后產物保存于-20℃條件下備用。

表1 microRNA引物序列

1.2.3 microRNA實時熒光定量PCR 使用 SYBR?premix Ex TaqTMⅡ（TaKaRa）檢測miR-483和miR-486在牛心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胎盤、子葉和子宮內膜組織的表達水平，美國Bio-Rad 7300公司進行定量PCR反應參數為：95℃預變性30 s；95℃ 5 s，60℃ 31 s熒光檢測1次，共40循環。記錄每個反應管中的熒光信號到達所設定的閾值時所經歷的循環數Ct值，反應結束后根據熔解曲線分析產物特異度，每組均設3個復孔，分析 miR-483和 miR-486 的相對表達量。

1.2.4 統計學分析 以U6 作為內參，miRNA的相對表達水平的數值通過2-ΔΔCt法進行計算。運用統計學軟件 SPSS16.0 進行單因素方差分析。

2 結果

2.1 miR-483在正常受精、克隆、轉基因魯西黃牛不同組織中的表達

miR-483在心臟中表達量最高，約為在肺臟中表達量的10倍，其次在腎臟中的表達量是肺臟中的6倍左右，在肺臟中的表達量最低（圖1）。

圖1 miR-483在牛不同組織中的表達

2.2 miR-486在正常受精、克隆、轉基因魯西黃牛不同組織中的表達

miR-486在心臟中表達量最高，約為在肝臟中表達量的13倍（P=0.021，具有顯著差異）；其次在肺臟中表達量是肝臟中表達量的2倍左右；在肝臟和子葉中表達量最低（圖2）。

2.3 miR-483和miR-486在正常受精、克隆、轉基因魯西黃牛心臟表達的比較

miR-483和miR-486在克隆牛、轉基因牛心臟中的表達要低于正常受精牛的心臟（圖3）。

圖2 miR-486在牛不同組織中的表達（a代表P＜0.05）

圖3 miR-483（A）和miR-486（B）在正常受精、克隆和轉基因魯西黃牛心臟表達（a代表P＜0.05）

3 討論

ω-3 PUFAS能提高心肌細胞的電穩定性，而心肌細胞的電穩定性的提高能防治心率不齊［5］，對體內ω-6/ω-3 PUFAS比值的改變和對體內脂代謝的調節，能有效的降低血壓、血脂［6］。武珅等［7］發現增加fat-1基因在體內的表達是預防心血管硬化的有效方法。miRNA 的表達具有時序性和空間特異性，王家驥等［8］通過對靶基因進行調節從而實現對動物發育的調控。隨著研究的不斷深入，人們逐漸認識到miRNA在進化過程中的保守性以及在生物進化和疾病發展過程中起著重要的調控作用，通過抑制靶基因的表達產生基因沉默的效應。

近年來研究發現，miRNA參與調控心臟病理生理過程，推測 miRNA 在心肌肥大、心肌梗死中扮演重要角色［9-11］。目前，在生物體內已鑒定出超過6 000個miRNA 分子，而在人類基因組中約30% 的基因受 miRNA調控［12］，其在心臟、肝臟及腦等不同組織中都具有特異性表達，有研究通過分析6個心衰胎兒和4個正常胎兒心臟microRNA芯片［13］，獲得110個顯著差異microRNA，其中miR-483和miR-486表達量顯著下調，推測與胎兒心衰有關。Sucharov等［14］通過對6個非心衰、5個缺血性擴張型心臟病和5個特發性擴張型心臟病的病人的microRNA芯片分析，也得出miR-483和miR-486在非心衰病人組中表達量顯著下調的結論，證明microRNA可能調控心肌疾病中關鍵性重編程重塑基因的表達，參與到心肌疾病中。郝艷坤等［15］篩查肥胖大鼠心臟microRNA的表達變化，尋找與肥胖誘發心肌損傷及心律失常相關的miRNA，發現在肥胖模型組的 miRNA 表達譜中明顯差異表達的miRNA共有 7個，其中miR-483表達下調，提示miRNA可能參與肥胖誘發心肌損傷和心律失常的調節作用。Zhang等［16］研究發現miR-483在懷孕和哺乳期喂養母體高脂肪（HF）飲食的子代中表達顯著降低。

miRNA的差異表達及對基因的調控機制已成為當前科學研究的熱點之一。miRNA可能參與調控多個靶基因，而一個基因也可能受多個miRNA調控。從miRBase數據庫中預測出人源的miR-483 定位于胰島素樣生長因子2（insulin-like growth factor 2，IGF2）的第2內含子［17］。Zhang等［16］的研究結果提示miR-483在喂養高脂肪飲食的小鼠后代中表達量顯著降低，同時伴隨著IGF2 mRNA表達水平顯著提高，預示著IGF2可能是miR-483的靶基因。小鼠胎兒體重可能受IGF2基因上的多態性的影響［18］，低濃度IGF2可能涉及增重和肥胖［19］。

miR-486在哺乳動物中是保守的，富集于心肌、骨骼肌和平滑肌中，肌肉生長抑制素（Myostatin）是骨骼肌生長的負調控因子，可降低肌肉中蛋白合成，Hitachi等［20］在敲除myostatin小鼠后發現miR-486表達水平顯著提高，證實miR-486可能是連接肌肉生長抑制素信號和調控骨骼肌通路中的調控分子。Small等［21］證明同源性磷酸酶-張力蛋白（PTEN）可能是miR-486靶位點，PTEN是磷酸肌醇3激酶/ Akt信號通路的負調控基因，后者是胰島素受體下游的主要通路，推測miR-486能在骨骼肌中調節胰島素依賴的葡萄糖攝取。本研究結果表明，miR-483和miR-486在正常受精和轉fat-1基因牛心臟中差異表達，提示其表達變化可能與fat-1表達有關。

4 結論

通過檢測miR-483和miR-486在正常受精、克隆、轉fat-1基因魯西黃牛不同組織中的相對表達水平，發現miR-483和miR-486在正常受精牛、克隆牛和轉fat-1基因牛的組織中均有表達，其中在心臟中表達量顯著高于其他組織。而轉基因牛心臟中miR-483和miR-486表達量均低于正常受精牛。

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（責任編輯 馬鑫）

Expression of microRNA-483 and microRNA-486 in the Cloned and fat-1-transgenic Bovine

Lü Yang1WANG Yu1，2SUN Jia-jia1GONG Chun-ling1LI Guang-peng1
（1. Research Center for Laboratory Animal Science，Inner Mongolia University，Hohhot 010070；2. The Affiliated Hospital，Inner Mongolia University，Hohhot 010050）

The expression levels of microRNA-483 and microRNA-486 in heart，liver，spleen，lung，kidney，placenta，cotyledons，endometrium from normal，cloned，and transgenic bovine were measured by real time quantitative PCR. The results showed that microRNA-483 and microRNA-486 were expressed in all tissues of normal，cloned and fat-1-transgenic bovine；significantly higher in the heart than other tissues. However，the expression levels of microRNA-483 and microRNA-486 in transgenic bovine were lower than normal one. Further，the expressions of microRNA-483 and microRNA-486 varied in different tissues and high in the heart，indicating that the expressions of microRNA-483 and microRNA-486 may be correlated with pathophysiological process of myocardial hypertrophy and myocardial infarction.

microRNA-483；microRNA-486；transgenic bovine；heart

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.017

2015-06-12

國家基礎研究計劃（2012CB722306）；國家級大學生創新訓練計劃項目（201410126034）

呂洋，男，博士研究生，研究方向：哺乳動物生殖生物學；E-mail：lvyang678762006@163.com

李光鵬，男，教授，研究方向：哺乳動物生殖生物學、胚胎生物技術；E-mail：gpengli@imu.edu.cn