七鰓鰻水通道蛋白3的克隆與生物學特性分析

趙春暉史金杰王浩劉欣李慶偉

（1.遼寧師范大學生命科學學院，遼寧省生物技術與分子藥物研發重點實驗室 大連 116081；2.遼寧師范大學七鰓鰻研究中心，大連 116081）

七鰓鰻水通道蛋白3的克隆與生物學特性分析

趙春暉1，2史金杰1王浩2劉欣2李慶偉2

（1.遼寧師范大學生命科學學院，遼寧省生物技術與分子藥物研發重點實驗室 大連 116081；2.遼寧師范大學七鰓鰻研究中心，大連 116081）

水通道蛋白3（aquaporin 3，AQP3）屬于水甘油通道蛋白家族，參與水、尿素和甘油的轉運和促進細胞增殖及遷移。從七鰓鰻中克隆得到了Aqp3（LjAqp3）cDNA（GenBank 序列號KR054618），其開放閱讀框為900 bp，編碼299個氨基酸，含6個跨膜螺旋結構域，有信號肽。序列分析結果表明，七鰓鰻AQP3有2個高度保守的天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸（NPA）模體和1個芳香族/精氨酸（ar/R）結構。進行同源序列比對發現與其它物種具有較高的同源性。實時熒光定量PCR分析表明，LjAqp3在七鰓鰻中分布廣泛，在多種組織器官中表達。

水通道蛋白3；七鰓鰻；天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸模體

膜內在蛋白（membrane intrinsic proteins，MIPs），也被稱為水通道蛋白（aquaporins，AQPs），是分子質量為26-35 kD的跨膜蛋白，可以促進水和小分子溶質運輸，如甘油、尿素、氨、金屬和二氧化碳。這些蛋白質構成了一個古老、豐富、非常復雜的蛋白質家族。AQPs具有高度保守的結構域，在細胞膜上以四聚體形式存在，每個單體由6個跨膜螺旋結構域組成，形成兩個選擇性孔道。一個孔道含有兩個相對的NPA（Asn-Pro-Ala）模體，與水分子形成氫鍵和質子靜電斥力，構成一個獨特的沙漏形孔道；另一個選擇性孔道含有ar/R（aromatic/arginine）模體，即Phe、Gly/Ser、Tyr/Ala 和Arg 4個氨基酸，位于孔道的最窄區域，控制著轉運底物的專一性［1-3］。

AQPs廣泛存在于動物、植物、微生物中，植物AQPs大致分為質膜內在蛋白（plasma intrinsic protein，PlPs）、液泡膜內在蛋白（tonoplast intrinsicproteins，TIPs）、類NOD26膜內在蛋白（nodulin 26-like intrinsic proteins，NIPs）、小分子堿性膜內在蛋白（small and basic intrinsic proteins，SIPs）、類GlpF膜內在蛋白（GlpF-like intrinsic proteins，GIPs）以及XIPs（X intrinsic proteins）和HIPs（hybrid intrinsic proteins）7種類型。位于生物膜上的AQPs參與水分跨膜運輸，進而調節細胞內與細胞間的水分流動，維持體內水分平衡，從而使細胞正常進行各種生理活動［3，4］。哺乳動物中AQPs的研究已十分廣泛，目前發現13種AQPs（AQP0-12），分為3個亞系：水通道蛋白（AQP0、1、2、4、5、6和8），超級水通道蛋白（AQP11和12）和水甘油通道蛋白（AQP3、7、9和10）。除了在體液的分泌、吸收以及調節細胞體積過程中對水的轉運，在細胞黏附、遷移、增殖和分化等過程中也發揮重要的作用，其機制可能參與由cAMP（cyclic adenosine monophosphate）、MAPK（mitogen-activated protein kinase）、PKC（protein kinase C）和PI3K/Akt/mTOR介導的信號轉導通路［5-7］。在魚中AQPs亞家族（AQP0-12）的序列分析也已完成，分為水通道蛋白（AQP0、1、4），水甘油轉運通道蛋白（AQP3和AQP7-10），水尿素轉運通道蛋白（AQP8）和兩個非典型的水通道蛋白（AQP11和12）［8］。

水通道蛋白3（aquaporin 3，AQP3）通常對水以及小分子溶質，如甘油和尿素具有通透性。哺乳動物AQP3在腎集合管、表皮、肺的氣道、結膜和膀胱等多種組織器官中表達；其表達水平受血管加壓素、cAMP、糖皮質激素和高滲性調控；鎳、銅離子或者酸性條件下可阻斷AQP3的運輸功能［6，9，10］。近來研究發現，AQP3是受Notch信號通路調控的靶基因之一，AQP3通過與Notch信號通路的相互作用，可以抑制角質形成細胞的分化［11］。AQP3還可通過激活ERK通路，進而增加基質金屬蛋白酶3（matrix metalloproteinase-3，MMP-3）在前列腺細胞中的表達和分泌，從而促進前列腺癌細胞的侵襲和轉移［12］。已有的研究表明，AQP3可能在細胞黏附、遷移、增殖和分化等過程中均發揮重要的作用，但其具體機制還需要進一步研究。有關魚類AQP3的研究還較少，包括斑馬魚（Danio rerio）［8］、鳉魚（Fundulus heteroclitus）［13］、鯪魚（Tribolodon hakonensis）［14］、鰻魚（Anguilla anguilla）［15］、羅非魚（Oreochromis mossambicus）［16］、薩羅羅非魚（Sarotherodon melanotheron）［17］。這些研究結果表明，AQP3與魚類的防止細胞腫脹、失水，參與尿素、甘油、氨轉運及滲透壓調節過程有密切關系。

在海洋生物中，七鰓鰻（Lampetra japonica）是迄今所知道的最原始的無頜類脊椎動物之一，它印記了無脊椎動物的進化歷史，也為脊椎動物的起源與進化提供了豐富的遺傳信息。在進化上，七鰓鰻是聯系無脊椎動物和脊椎動物之間的重要階元，具有極高的研究價值［18］。本研究首次克隆得到七鰓鰻（L. japonica）Aqp3基因cDNA全長序列，并進行序列進化和組織特異性表達水平的分析，旨在為進一步研究水通道蛋白的進化及其在七鰓鰻中的功能提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 成年七鰓鰻購買自黑龍江省松花江流域同江地區，體重約112.0-274.3 g，體長約36.4-58.4 cm，七鰓鰻活體馴養在實驗室水族箱內（2-5℃），3-4周后進行實驗。

1.1.2 試劑 DNA純化試劑盒、質粒小量提取試劑盒、RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、TaKaRa 3'-Full RACE Core Set Ver.2.0、SYBR PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒及DNA Marker等均購于寶生物工程（大連）公司。

1.1.3 引物合成和測序 引物合成及重組質粒目的基因測序由生工生物工程（上海）股份有限公司測定。

1.2 方法

1.2.1 克隆七鰓鰻Aqp3 基因cDNA全長序列 從七鰓鰻血液中分離外周血白細胞［19］，用RNAiso Plus試劑提取mRNA反轉錄合成cDNA。七鰓鰻Aqp3（LjAqp3）的EST序列來自本實驗室構建的七鰓鰻白細胞cDNA文庫（4.5×106pfu/mL），設計引物見表1。LjAqp3 RT-PCR擴增反應條件：94℃ 3 min；94℃1 min，56℃ 30 s，72℃ 1 min，共35個循環；最后72℃延伸10 min。提取質粒進行DNA測序，獲得cDNA片段。3' RACE擴增按照TaKaRa公司的3'-Full RACE Core Set Ver.2.0試劑盒說明書進行，1st PCR 反應程序：94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，25個循環；2nd PCR 反應程序：94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，35個循環。RACE產物經純化、克隆和測序后，用DNAman（Lynnon Biosoft）軟件拼接獲得七鰓鰻Aqp3基因cDNA全長序列。重新設計引物擴增ORF區，PCR反應條件：94℃ 3 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，共30個循環；最后72℃延伸10 min。

1.2.2 LjAQP3氨基酸序列及系統進化分析 根據測序結果進行拼接得到LjAqp3的全長cDNA序列，用Bioedit 7.0軟件推測其編碼的氨基酸序列，開放閱讀框（ORF）分析使用NCBI在線預測軟件（http：//www. ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）。信號肽預測分析使用SignalP 4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）。跨膜區域預測使用TMHMM Server v. 2.0（http：//www. cbs.dtu.dk/services/TMHMM/），用ClustalX 2.0軟件進行多重序列比對，用MEGA 6.0軟件neighbor-joining（NJ）法進行系統發育樹的構建。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測LjAqp3 mRNA轉錄水平 使用RNAiso Plus試劑分別提取3條七鰓鰻的眼、鰓、腎、腸、腦、肌肉、口腔腺、生殖腺（雄性）、卵（雌性）及白細胞的總RNA。使用gDNA Eraser對RNA樣品進行純化。LjAqp3 mRNA轉錄分析使用TaKaRa的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 反轉錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTMII熒光染料和TaKaRa TP7500 PCR檢測系統。七鰓鰻GAPDH基因作為內參（表1）。PCR反應體系為25 μL，包含12.5 μL Master SYBR Green（TaKaRa）mix，1 mL 引物（10 mmol/L），2 mL cDNA（100 ng/ mL）及水。PCR反應條件為：95℃ 30 s；95℃ 5 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個循環。每個樣品均重復3次，得到特異性的熔解曲線和擴增曲線，通過2%瓊脂糖凝膠電泳確認反應是否完成。使用2-ΔΔCt方法對LjAqp3 mRNA轉錄水平進行計算分析［20］。

表1 PCR引物的序列

2 結果

2.1 LjAqp3基因克隆及序列分析

RT-PCR擴增得到長806 bp的片段，克隆測序后經BLAST分析確認為LjAqp3基因的核心序列，3' RACE獲得 224 bp的3' 末端序列，將這2部分序列拼接最終得到LjAqp3基因的全長cDNA序列1 137 bp。用LjAqp3 Forward和 LjAqp3 Reverse擴增得到900 bp的ORF區。LjAqp3完整的cDNA序列及其氨基酸序列（圖1）顯示，LjAqp3 cDNA的全長序列包括13 bp 5'非翻譯區（5' UTR），900 bp的閱讀框ORF以及224 bp 3' 非翻譯區（3' UTR），推測ORF可編碼299個氨基酸，蛋白質分子質量預測為32.1 kD，理論等電點為8.86。七鰓鰻Aqp3基因的3' UTR有一個polyA加尾信號AATAAA。通過氨基酸序列分析發現，LjAQP3的-NH2和COOH-均位于膜內，含有2個形成水孔道的天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸（Asn-Pro-Ala，NPA）模體。信號肽和跨膜區域預測結果表示，LjAQP3的 N 端前 27 個為信號肽，含有6個跨膜螺旋結構域，即TM1-TM6（21-43，58-80，101-123，156-175，188-210，238-260），同時由5個loop環連接，即loopA-E（44-57，81-100，124-155，176-187，211-237），其中3個胞外環loopA、loopC、loopE，2個胞內環loop B和loop D，而loop B和loop E均為半螺旋環（圖1）。LjAqp3序列已被提交到NCBI數據庫（KR054618）。

AQP3單體的6個跨膜螺旋結構域（TM1-TM-6），2個NPA模體分別位于loop B和loop E半螺旋環上，形成芳香族/精氨酸（ar/R）結構的4個氨基酸殘基以及形成水孔道的5個保守殘基P1-P5（Y、D、R、P和I/V）（圖2-A）。使用ClustalX 2.0軟件對LjAQP3與其它11個物種AQP3進行序列比對，序列分析發現LjAQP3同其它物種有很高的保守性，含有較多的同源序列（圖2-B）。與非洲爪蟾（Xenopus（Silurana）tropicalis）、日本鰻鱺（Anguilla japonica）、斑馬魚（Danio rerio）、原鰭魚（Protopterus annectens）、歐洲鱸（Dicentrarchus labrax）、薩羅羅非魚（Sarotherodon melanotheron）、底鳉（Fundulus heteroclitus）、暗紋東方鲀（Takifugu obscurus）、羅非魚（Oreochromis mossambicus）、金頭雕（Sparus aurata）和恒河青鳉（Oryzias dancena）的相似性分別為82%、82%、83%、85%、79%、79%、81%、80%、79%、78%和92%。第一個高度保守的NPA前端序列為SGGH（L/I），第二個高度保守的NPA后端序列為RD，且其羧基末端的序列-KKXX幾乎都包含2個賴氨酸殘基。苯丙氨酸（F63）、甘氨酸（G199）、酪氨酸（Y208）、精氨酸（R214）4種氨基酸殘基形成1個ar/R結構。

圖1 LjAqp3基因全長cDNA及其氨基酸序列

使用MEGA 6.0軟件中neighbor-joining建樹方法對LjAQP3與其它16個物種AQP3/AQP進行系統發育樹構建（圖3），相似性見表2。系統發育樹主要包括4個集群：（1）哺乳動物、鳥類和爬行動物（小鼠、人、恒河猴、半環扁尾蛇、鳳頭鸊鷉、鵪鶉）；（2）兩棲動物和魚類（非洲爪蟾、日本鰻鱺、斑馬魚、原鰭魚、歐洲鱸、薩羅羅非魚）；（3）節肢動物（蚤水溞、海虱）；（4）線形動物（錫蘭鉤蟲）；果蠅為Out group。LjAQP3處于“兩棲動物和魚類”分支。

圖2 LjAQP3同源序列多重比對

2.2 LjAqp3基因在各組織中的表達分析

對七鰓鰻各個組織中LjAqp3的轉錄水平進行測定。設LjAqp3基因在腦中表達量為1，根據LjAqp3在各組織中的相對表達量作圖。結果（圖4）表明，LjAqp3在七鰓鰻上述10種組織中均有表達，其中在鰓中表達量最高；其次是肌肉、口腔腺、腸、腎、卵、生殖腺、白細胞；而在眼中表達量較少。

圖3 鄰接法構建LjAQP3的系統發育樹

表2 LjAQP3與其他已知物種的水通道蛋白氨基酸相似性

圖4 實時熒光定量PCR檢測正常七鰓鰻各組織中LjAqp3 mRNA表達

3 討論

水通道蛋白是一個古老、豐富、非常復雜的跨膜轉運蛋白家族，其可運輸水分或小分子溶質，如甘油、CO2、尿素等。至今，哺乳動物中已發現13個成員；植物中已發現7種類型；兩棲類、魚類、昆蟲、菌類中也相繼發現不同成員［2-4］。水通道蛋白3屬于水甘油轉運蛋白，其分布廣泛，與多種體內代謝活動相關。

七鰓鰻以其獨特的進化地位和獨有的免疫系統成為研究脊椎動物免疫系統起源和進化的重要物種［21］。本研究首次從七鰓鰻中克隆得到AQP3基因。其氨基酸序列顯示，LjAQP3含有兩個典型的NPA（T）基序和1個ar/R結構域，并保留了較多高度保守的殘基（Y123、D215、R219、P242和V243/I243）和氨基酸序列（GT、ILV、FGCG、AFGF、SGGHLNPA、VIF、IGT、AL、NNPXP、IG、SMGXN、VNPARD、GPR和GWG）［8］。LjAQP3的2個NPA模體和1個ar/R結構對水或溶質分子（如甘油和尿素等）孔道的形成非常關鍵［2，22，23］。在與非洲爪蟾、日本鰻鱺、斑馬魚等11個物種的AQP3進行序列比對時發現，這些物種的AQP3的B環上均有半胱氨酸（Cys91），該半胱氨酸為汞的抑制位點，AQP3也因此被稱為汞敏感水通道蛋白［9-13］。而七鰓鰻AQP3的序列中該位點已被丙氨酸（Gla91）取代，表明七鰓鰻AQP3有其結構和功能的獨特性，其具體結構與功能還有待進一步研究。

氨基酸序列比對分析表明本研究獲得的水通道蛋白3的序列與其它物種的AQP3具有較高的同源性，與恒河青鳉（Oryzias dancena）AQP3序列最為相似，氨基酸酸同源性高達92%。七鰓鰻是目前存在的最古老的脊椎動物之一。系統發育樹分析表明，LjAQP3可能是AQP3較原始的形式，相較于節肢動物，其結構上與高等動物AQP3更加接近，位于高等脊椎動物AQP3的“魚類”分支，這也與目前研究的七鰓鰻的進化地位相一致。

哺乳動物AQP3在腎集合管、表皮、肺的氣道、結膜和膀胱等多種組織器官中表達［9］。七鰓鰻AQP3在檢測的眼、鰓、腎、腸、腦、肌肉、口腔腺、生殖腺（雄性）、卵（雌性）、白細胞組織及細胞中均有表達，表明其作為細胞膜重要的水通道蛋白，在水和非離子型的溶質運輸及維持機體體液穩態中起著至關重要的作用。其中，在鰓中表達量最高，可能與鰓作為滲透壓調節的主要器官，是體內與體外環境進行離子和水交換的主要場所有關［17］。七鰓鰻AQP類型分布是否有著組織細胞部位的選擇性，其在體內受到哪些因素的調節，將是下一步深入研究的問題。

4 結論

本研究首次從七鰓鰻中克隆了LjAqp3基因，基因全長1 137 bp，由900 bp的開放閱讀框組成，可編碼299個氨基酸，含有6個跨膜螺旋結構域和一個信號肽；有2個NPA模體和1個ar/R結構；其序列具有較高的保守性；LjAqp3在七鰓鰻中分布廣泛，在多種組織器官中表達。

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（責任編輯 馬鑫）

Cloning and Biological Characterization of Aquaporin 3 from Lampetra japonica

ZHAO Chun-hui1，2SHI Jin-jie1WANG Hao2LIU Xin2LI Qing-wei2
（1. Liaoning Provincial Key Laboratory of Biotechnology and Drug Discovery，College of Life Sciences，Liaoning Normal University，Dalian 116081；2. Lamprey Research Center，Liaoning Normal University，Dalian 116081）

Aquaporin 3（AQP3）belongs to the family of aquaglyceroporin，and it involves in the transport of water，urea and glycerol and promotes cell proliferation and migration. In this study，the complete cDNA sequence of Aqp3（designated as LjAqp3）was cloned from Arctic lamprey Lampetra japonica（GenBank accession number KR054618）. The open reading frame of LjAqp3 was 900 bp，encoding 299 amino acids，with a predicted 6 transmembrane helix domains and a putative signal peptide. There were 2 highly conserved asparagine-prolinealanine（NPA）motifs and the aromatic/arginine（ar/R）structure in LjAQP3. Additionally，LjAQP3 shared high sequence homology with AQP3 of other species. Real-time quantitative PCR revealed the constitutive expression of LjAqp3 in multiple tissues and organs.

aquaporin 3；Lampetra japonica；asparagine-proline-alanine motif

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.021

2015-06-23

國家自然科學基金項目（31170353）

趙春暉，女，副教授，碩士生導師，研究方向：細胞生物學與蛋白質工程；E-mail：zch@lnnu.edu.cn