塞來昔布和5-FU聯用對人胃癌細胞增殖、VEGF和Survivin表達的影響

揚州大學臨床醫學院（揚州市蘇北人民醫院）（225001）宋樹祥 陳平 柳欣欣 趙艷

胃癌的發生、發展與多種細胞因子的過度表達相關。近年來研究表明選擇性環氧化酶-2（COX-2）在胃癌細胞中大量表達，其抑制劑對胃癌是否有抑制作用一直是研究熱點[1]。很多研究者通過基礎及臨床的多種研究認為，COX-2抑制劑在抗腫瘤方面有重要作用，尤其是消化系統腫瘤，雖然COX-2抑制劑在腫瘤發展過程中的具體機制仍未闡明，但其作用明顯抑制腫瘤細胞生長。COX-2、血管內皮生長因子（VEGF）以及凋亡相關基因Survivin之間可互相調節、協同作用，共同促進腫瘤的生長、侵襲和轉移[2][3]。我們應用選擇性COX-2抑制劑塞來昔布作用于胃癌細胞株，觀察其對胃癌細胞增殖的影響；并將其與治療胃癌的常用化療藥物5一氟尿嘧啶(5-FU)聯用，探討兩者抑制胃癌細胞增殖、誘導凋亡可能的協同作用和相關的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 材料①實驗細胞：人胃癌細胞株BGC-823系購自中國科學院上海細胞庫。②主要試劑：塞來昔布購自美國輝瑞公司，5-FU購自Sigma公司；RPMI-DMEM培養基購自美國GIBCO公司、胎牛血清和胰蛋白酶購自杭州四季青公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）及二甲基亞砜（DMSO）購自Sigma公司；RNA提取試劑盒購自北京天根公司，RT-PCR試劑盒購自南京唯贊生物科技公司；Marker、VEGF、Survivin、β-actin引物由深圳華大基因公司合成；③主要儀器：酶標儀、梯度PCR儀、核酸擴增儀、電泳槽、凝膠成像分析系統。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 BGC-823胃癌細胞培養使用RPMI-DMEM培養基，使用時均加入10%的小牛血清和雙抗（100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素），置細胞于含有5%的CO2、37℃飽和濕度的細胞培養箱中培養，該細胞系在培養皿中貼壁生長，待細胞長到整個培養皿的85%～90%，用0.25%胰酶消化傳代，實驗用細胞已傳至8代。

1.2.2 MTT比色分析法 選擇對數生長期的BGC-823細胞，2.5g/L胰蛋白酶消化，以RPMl-DMEM培養基調整細胞懸液濃度為1×108/L，接種于96孔板(1×104/孔)，每孔接種100uL，貼壁24h后，分別加入含有不同濃度(0、100、200、300、400umoL/L)塞來昔布孵育24h、48h、72h后分別加入MTT，再孵育4h，棄去孔內液體，加入二甲基亞砜，在酶標儀490nm波長處檢測各孔吸光度(A)值，抑制率=(1-實驗組A/對照組A)×100%，對照組中細胞培養為普通營養液加入相同含量DMSO混合液。邊緣空以PBS覆蓋減少實驗誤差。

1.2.3 逆轉錄聚合酶鏈反應 以cDNA為模板，進行PCR反應以擴增VEGF和Survivin基因序列，選擇β-actin作為內參照。細胞接種于6孔板中，貼壁后分別用塞來昔布IC50、5-FU（200umoL/L）及塞來昔布聯合5-FU孵育48h。收獲細胞1×107，RNA試劑盒法提取細胞總RNA。取5ulRNA按照Vazyme試劑盒說明書進行逆轉錄合成cDNA. RNA500/檢測濃度。以cDNA為模板，進行PCR反應以擴增VEGF和Survivin基因序列，選擇β-actin作為內參照。引物序列設計：VEGF上游引物為：5’-ATGAACTTTCTGCTGTCTTG-3’，下游引物為：5’-TGCATGGTGATGTTGGAC-3’，擴增片斷大小為382 bp，Survivin上游引物為：5’-GGCATGGGTGCCCCGACGTT-3’，下游引物為：5’-AGAGGCCTCAATCCATGGCA-3’，擴增片段大小為439bp，內參β-actin的上游引物為：5’-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3’，下游引物為：5’-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3’，擴增片段大小為564bp。反應條件：94℃預變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共擴增35個循環。72℃徹底延7min。將擴增產物在70～80V電壓下電泳，30min后于凝膠成像及分析儀上進行圖像成像，將電泳結果放在凝膠成像分析儀中分析結果。

附圖1 不同作用時間塞來昔布對BGC-823胃癌細胞lC50值

附圖2 M：Marker；A：對照組；B：塞來昔布200umoL/L；C：5-FU200umoL/L；D：塞來昔布+5-FU200umoL/L

附圖3 M：Marker；A：對照組；B：塞來昔布200umoL/L；C：5-FU200umoL/L；D：塞來昔布+5-FU200umoL/L

1.3 統計學方法 結果采用方差分析，兩樣本均數采用t檢驗，數據以x±s表示，數據處理采用SPSS19.0統計學軟件。以P≤0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 塞來昔布對BGC-823胃癌細胞增生的影響 隨著藥物濃度升高和時間延長，BGC-823胃癌細胞活性明顯下降，24h、48h、72h塞來昔布干預BGC-823胃癌細胞IC50為(255.36±21.1)umoL/L、(149.12±2.29)umoL/L、(89.95±1.61)umoL/L(見附圖1)。

2.2 塞來昔布聯合5-FU對VEGF和Survivin mRNA表達的影響 VEGF和Survivin mRNA在BGC-823胃癌細胞中表達正常。塞來昔布和5-FU聯用可完全抑制VEGF和Survivin mRNA在BGC-823胃癌細胞中的表達，單獨用藥組也可抑制VEGF和Survivin mRNA的表達，但抑制效果無聯合應用顯著，見附圖2、3。

3 討論

近年來，COX-2在消化道腫瘤中所起的作用日益受到重視。COX-2又稱前列腺素內過氧化物合成酶，具有環氧合酶和過氧化物合成酶的功能，主要分布在腫瘤組織和腫瘤微血管組織中，在多種腫瘤組織和轉移灶中高表達，可促進腫瘤細胞增殖、抑制腫瘤細胞凋亡，促進腫瘤血管生成，增加腫瘤浸潤轉移能力，抑制機體免疫功能，從而促進腫瘤的發生、發展和侵襲、轉移等[4][5]。

COX-2選擇性抑制劑塞來昔布在很多動物模型中抑制腫瘤的發生：在偶氮甲烷所致的鼠大腸癌模型中，塞來昔布可使大腸癌的發生率和腫瘤數量分別減少93%和97%，并抑制異常結腸腺管灶的形成[6]。在體外培養細胞中，研究發現塞來昔布對肝癌HepG2細胞株[7]及SMMC-7721細胞株陽[8]、結腸癌細胞株HT-29[9]，均有程度不同的抑制率。但是塞來昔布抑制腫瘤發生的機制目前還不十分清楚，這種作用可涉及多方面：如抑制腫瘤血管的形成[10]，抑制腫瘤細胞增殖，誘導腫瘤細胞亡，對磷酸化ERK表達的影響，并有可能逆轉腫瘤消耗引起的消瘦而對正常細胞的結構、凋亡無明顯影響[11]。目前，關于COX-2抑制劑對腫瘤的抑制作用及其機制的研究已成為熱點。我們研究選擇性COX-2抑制劑塞來昔布和5-FU聯用對胃癌細胞殺傷和誘導凋亡抑制VEGF以及Survivin mRNA的表達的作用，其目的是為臨床化療藥物和選擇性COX-2抑制劑聯合抗腫瘤治療新思路的實行提供一些理論依據。本研究中，我們應用塞來昔布干預BGC-823胃癌細胞，通過計算塞來昔布對BGC-823胃癌細胞的IC50值，從而明確，濃度梯度不變，隨著時間延長，BGC-823胃癌細胞增生受到抑制。

VEGF的表達與腫瘤的生長速度、微血管密度、血管結構及腫瘤轉移等腫瘤的多種生物學特征有密切關系[12][13]。COX-2主要表達在新生的血管內皮細胞和形成血管的細胞中，目前認為COX-2主要通過以下幾種途徑促進腫瘤血管的生成：一方面COX-2可使腫瘤中VEGF的表達上調，抑制COX-2可抑制VEGF的表達；另一方面VEGF又可上調COX-2的表達，從而形成一個正反饋網絡，協同刺激腫瘤血管生成[14]。研究認為COX-2可以促進腫瘤生長，從而導致腫瘤組織局部呈缺氧狀態，此時HIF-1被迅速激活，激活后的HIF-1又可以促進VEGF的轉錄，增加VEGF的表達。

隨著新的凋亡抑制家族成員的發現，很多腫瘤中發現Survivin高表達，包括肺癌、直腸癌、胰腺癌、前列腺癌及乳腺癌[15][16]。Srvivin是一種新發現的抑制細胞凋亡的蛋白IAP家族成員，定位于人染色體17q25上。其在腫瘤細胞凋亡調控方面發揮至關重要的作用。很多學者集中研究Survivin與胰腺癌的關系。Satoh等[17]列發現，在胰腺導管癌中Survivin表達率為76.9%，導管乳頭狀鈣黏蛋白瘤中表達率為56.3%。Survivin在惡性腫瘤中的表達遠遠高于良性腫瘤的表達。Survivin的主要作用為抑制腫瘤細胞凋亡和促進細胞增殖，是迄今發現的最強的凋亡抑制基因，同時也是預后不良的因素之一。因而，其已經成為腫瘤靶向治療的一個新靶點。國外對前列腺癌和大腸癌的研究表明[18]，選擇性COX-2抑制劑可通過抑制survivin表達而達到治療腫瘤的目的。然而也有不同意見，Lubet RA和Gradilone A分別通過對膀胱癌和肺癌的研究表明[19]。COX-2抑制劑并不能影響survivin的表達。我們的研究發現，塞來昔布、5-FU及塞來昔布聯合應用5-FU均可抑制VEGF和Survivin的表達，并且塞來昔布聯用5-FU抑制效果最為明顯。

本實驗發現，塞來昔布對胃癌細胞BGC-823的生長有抑制作用，同時，對化療藥物的不敏感和耐藥是目前胃癌治療中存在的主要問題。我們的體外研究表明，選擇性COX-2抑制劑和5-FU的聯用可顯著提高胃癌細胞的殺傷率和凋亡發生率。然而，目前對于塞來昔布抑制腫瘤生長的確切機制尚不十分清楚，但我們相信，隨著研究的不斷深入，選擇性COX-2抑制劑和化療藥物的聯用有可能成為胃癌治療的一種新方法。