胃癌組織中節律基因Period1和Period2的表達變化及意義

王蘭芳，林娟，王小敏

(1海口巿中醫院,海口570203；2海南省中醫院)

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胃癌組織中節律基因Period1和Period2的表達變化及意義

王蘭芳1，林娟2，王小敏1

(1?？趲堉嗅t院,?？?70203；2海南省中醫院)

目的觀察節律基因Period1和Period2在胃癌組織中的表達變化，并探討其臨床意義。方法 選擇138例胃癌患者，術中留取胃癌及癌旁組織，采用免疫組化法檢測胃癌及癌旁組織中的Period1和Period2，實時熒光定量PCR法檢測胃癌及癌旁組織中的Period1和Period2 mRNA。結果胃癌組織中Period1和Period2陽性表達率分別為23.2%、31.2%，均低于癌旁組織中的44.9%、64.5%(P均<0.01)；胃癌組織中Period1 mRNA和Period2 mRNA相對表達量分別為1.05±0.10、1.09±0.12，均低于癌旁組織中的1.31±0.13、1.47±0.16(P均<0.01)；Period1 mRNA表達與胃癌組織分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移和Lauren分型有關(P均<0.05)，Period2 mRNA表達與胃癌組織分化程度、浸潤深度、TNM分期、淋巴結轉移和Lauren分型均有關(P均<0.05)；相關性分析顯示，胃癌組織中Period1與Period2表達呈正相關(r=0.285，P<0.05)，Period1 mRNA與Period2 mRNA表達呈正相關(r=0.379，P<0.05)。結論 胃癌組織中節律基因Period1和Period2呈低表達，可能在胃癌的發生、發展中起重要作用。

胃癌；節律基因；Period1；Period2

胃癌是我國常見的消化道惡性腫瘤，患者早期多無明顯癥狀或癥狀輕微，易錯過最佳的治療時機，多數患者臨床確診時已處于晚期，預后不佳[1]。因此，早期發現胃癌患者對改善患者預后具有重要意義。研究表明[2]，胃癌發生及進展過程涉及多種癌基因和抑癌基因的相互作用及由此而導致的一系列細胞生物學行為變化。研究發現[3]，生物鐘節律在維持正常生物節律及細胞增殖、凋亡周期中發揮重要作用。生物節律一旦發生改變，可導致睡眠時相提前綜合征、季節性情感鐘愛、腫瘤等疾病的發生[4]。Period1和Period2是重要的生物節律基因，在調節生物鐘節律中發揮重要作用。有研究發現，將小鼠Period基因敲除后，其腫瘤發生及細胞增殖和異型性變化顯著增加[5]。有研究發現[6]，Period1和Period2在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等惡性腫瘤中異常表達。但是，有關節律基因在胃癌發生、發展中的作用鮮有報道。本研究觀察了Period1和Period2在胃癌組織中的表達變化，探討二者在胃癌發生及進展中的意義。

1　資料與方法

1.1臨床資料選取2012年2月～2015年8月在?？谑兄嗅t院擇期行手術切除治療的胃癌患者138例，其中男81例、女57例，年齡(59.8±9.5)歲。所有患者術前未接受放化療，術后經病理學檢查確診；腫瘤位于胃體部59例，胃底和賁門部69例；腫瘤最大徑≥5 cm 54例，<5 cm 84例；組織分化程度：低分化75例，中分化34例，高分化29例；浸潤深度：黏膜及黏膜下層21例，肌層25例，漿膜層92例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期53例，Ⅲ～Ⅳ期85例；Lauren分型：彌漫型61例，腸型77例；發生淋巴結轉移83例。術中均留取患者胃癌組織及癌旁>5 cm的正常胃組織，-70 ℃液氮中保存以備檢。

1.2主要試劑與設備兔抗人Period1多克隆抗體購自美國Abcom公司，兔抗人Period2多克隆抗體購自美國Abnova公司；TRIzol總RNA提取試劑盒購自美國Invitrogen公司，逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒均購自大連博瑞得生物公司，Period1、Period2及其內參引物均由上海生工公司設計并合成，MaxVision2/HRP試劑盒購自福建邁新生物技術公司，實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.3胃癌及癌旁組織中Period1和Period2檢測采用免疫組化法。取胃癌及癌旁組織，于4%甲醛溶液固定、石蠟包埋、切片、脫蠟；用3% H2O2浸泡15 min，PBS沖洗3次；用胰蛋白酶消化10 min，用PBS沖洗3次；將兔抗人Period1、Period2多克隆抗體(PBS代替一抗作為陰性對照)加入，室溫下孵育60 min，PBS沖洗3次；將多聚酶標二抗加入，室溫下孵育15 min，PBS沖洗3次；用DAB顯色5 min，水洗、復染、脫水、透明、封片、觀察。結果判定：于100倍光學顯微鏡下選取結構良好、背景清晰的5個視野，高倍鏡下每個視野計數100個細胞，計算陽性細胞率。陽性細胞率<25%為1級，25%～﹤50%為2級，50%～﹤75%為3級，≥75%為4級；1級為陰性，2～4級為陽性。

1.4胃癌及癌旁組織中Period1和Period2基因檢測采用實時熒光定量PCR法。取胃癌及癌旁組織，研磨后用細胞裂解液裂解；用TRIzol總RNA提取試劑盒提取組織的總RNA，并檢測純度，取A260/A280≥1.80標本完成后續實驗。利用逆轉錄試劑盒逆轉錄為模板單鏈cDNA，以cDNA為模板利用PCR試劑盒完成PCR。Period1、Period2和內參引物：Period1上游引物5′-CCCACCCCACCAGCCACTAC-3′，下游引物5′-CCTGTGCCGGAGCGCGAGTC-3′； Period2上游引物5′-ATCTCTGACCAGGTTGCATC-3′，下游引物5′-CCAGAGTGCACTCTCTCTGC-3′；內參GAPDH上游引物5′-CCAAAATCAGATGGGGCAATGCTGG-3′，下游引物5′-TGATGGCATGGACTGTGGTCATCA-3′。PCR反應條件：94 ℃預變性2 min；92 ℃ 60 s，92 ℃ 45 s，56 ℃ 30 s，74 ℃ 30 s，連續進行40個循環后終止反應。每個樣品均設置3個平行反應復孔，用2-ΔΔCt法獲得胃癌及癌旁組織中Period1和Period2基因相對表達量。

2　結果

2.1胃癌及癌旁組織中Period1和Period2表達比較胃癌組織中Period1和Period2陽性表達率分別為23.2%(32/138)、31.2%(43/138)，均低于癌旁組織中的44.9%(62/138)、64.5%(89/138)，差異均有統計學意義(P均<0.01)。

2.2胃癌及癌旁組織中Period1和Period2基因表達比較胃癌組織中Period1 mRNA和Period2 mRNA相對表達量分別為1.05±0.10、1.09±0.12,均低于癌旁組織中的1.31±0.13、1.47±0.16，差異均有統計學意義(P均<0.01)。

2.3Period1和Period2基因表達與胃癌臨床病理特征的關系胃癌組織中Period1 mRNA表達與胃癌患者的年齡、性別及腫瘤最大徑、腫瘤位置和TNM分期均無關(P均>0.05)，而與分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移和Lauren分型有關(P均<0.05)；Period2 mRNA表達與胃癌患者的年齡、性別及腫瘤最大徑、腫瘤位置均無關(P均>0.05)，而與腫瘤分化程度、浸潤深度、TNM分期、淋巴結轉移和Lauren分型有關(P均<0.05)。見表1。

表1　Period1和Period2基因表達與胃癌臨床病理特征的關系

2.4胃癌組織中Period1和Period2表達的關系胃癌組織中Period1與Period2表達呈正相關(r=0.285，P<0.05)，Period1 mRNA與Period2 mRNA表達呈正相關(r=0.379，P<0.05)。

3　討論

胃癌作為消化系統較為常見的惡性腫瘤，由于目前尚無有效的早期檢測手段，且腫瘤惡性程度高、侵襲及轉移能力強，多數患者預后不佳。因此，胃癌的相關發生機制一直是臨床研究熱點。近年相關研究發現[7]，機體正常生理活動具有節律性，這種節律模式受機體節律基因的調控。節律基因在調控細胞增殖周期和凋亡、器官功能中發揮重要作用，同時，亦可影響腫瘤細胞的生長、轉移、侵襲過程[8]。Period1和Period2是維持正常機體節律所必需的節律基因，越來越多的研究發現二者也是潛在的抑癌基因。Period1表達上調可通過激活癌細胞DNA損傷而誘導細胞凋亡發生[9]，與乳腺癌[10]、前列腺癌[11]等惡性腫瘤的發生有關；Period2過表達可導致細胞分化減少并加速凋亡發生，亦可通過重置細胞周期阻滯細胞在G2/M期而影響細胞周期進程[12]。本研究免疫組化檢測結果顯示，胃癌組織中Period1和Period2陽性表達率均低于癌旁組織；實時熒光定量PCR檢測結果顯示，胃癌組織中Period1 mRNA和Period2 mRNA相對表達量均低于癌旁組織。說明Period1和Period2在胃癌組織中呈低表達，可能在胃癌發生中發揮抑癌基因的功能。

本研究結果顯示，Period1 mRNA表達量與胃癌組織分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移和Lauren分型有關，即分化程度越高、浸潤深度越淺、不發生淋巴結轉移及Lauren分型彌漫型，Period1表達水平越高。說明Period1基因可能與胃癌發生及細胞侵襲、轉移性有關，Period1表達受抑制可減少細胞凋亡發生、增強腫瘤細胞侵襲性[13]。本研究顯示，Period2 mRNA表達量與分化程度、浸潤深度、TNM分期、淋巴結轉移和Lauren分型有關(P均<0.05)，說明Period2亦與胃癌細胞侵襲、轉移性有關；Period2低表達可加速胃癌進展，可能與其低表達加速細胞周期進程有關[14]。相關分析結果顯示，胃癌組織中Period1表達與Period2表達呈正相關，說明節律基因Period1與Period2可能發生協同作用而促進胃癌發生及進展過程。

綜上所述，Period1和Period2在胃癌組織中呈低表達，可能與腫瘤發生及轉移、侵襲性有關，但具體作用機制尚待進一步從細胞、分子水平予以深入研究明確。

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