豬流行性腹瀉病毒湖北株的分離鑒定及其s1基因進化分析

桂銳 郭銳 田永祥 李文浩 蔡行 段正贏 楊克禮 劉澤文 袁芳艷 劉威 邢崔昱 周丹娜

摘要：豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）是豬的腸道傳染病病原，主要引起仔豬嘔吐、腹瀉和脫水，對一周齡內的哺乳仔豬危害最為嚴重，死亡率可達50%～100%。利用Vero86細胞從湖北某豬場腹瀉仔豬小腸病料中分離到一株病毒，經RT-PCR檢測、序列比對后確定其為PEDV，命名為HB201503株。設計PEDV s1基因的全長擴增引物，獲得該株病毒的s1基因全長序列并進行了進化分析，結果表明該毒株與近年來在GenBank 登陸的PEDV s1基因核苷酸序列相似性在91.4%～99.2%，與疫苗株CV777相似性較低，僅為91.8%。通過s1基因進化樹分析表明HB201503以及近幾年國內分離毒株主要集中在第 I 個亞群，且HB201503株與KM406183（2014，四川）和KM609206（2015，江蘇）同源性較高。此外，s1蛋白氨基酸序列比對顯示，HB201503與近幾年分離毒株及疫苗株CV777均在 55-74、157-163位氨基酸出現了連續4個以上氨基酸的缺失或替換，而且HB201503株與CV777及近幾年分離毒株相比，還在270-283位氨基酸上出現了1個氨基酸的缺失和10個氨基酸的替換。

關鍵詞：豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）；分離鑒定；s1基因；進化分析

中圖分類號：S852.65 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）06-1506-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.06.036

豬流行性腹瀉是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的急性、接觸性、高度傳染性消化道疾病，主要癥狀為嘔吐、水樣腹瀉和脫水[1]。各日齡的豬均易感染，其中以哺乳仔豬、斷奶仔豬和育肥豬發病率最高，尤其以哺乳仔豬受害最為嚴重[2]。20世紀90年代后期，中國開始大面積使用傳染性胃腸炎和流行性腹瀉二聯苗進行免疫，取得了很好的效果。然而最近幾年，豬場在廣泛應用PED滅活疫苗和弱毒疫苗的同時，仔豬流行性腹瀉不斷發生，甚至呈局部暴發流行，這提示可能PEDV發生了變異[3]。對中國最近幾年流行性腹瀉病毒進化發育分析表明，近年來大規模暴發流行性腹瀉的原因可能是流行性腹瀉病毒的s基因發生了變異[4]。PEDV的S蛋白可分為S1（1aa-735aa）區和S2（736aa-1383aa）區，其中S1區包含多個病毒主要中和表位和受體結合域，與病毒抗原性和吸附入侵密切相關[5]。因此對PEDV的分離鑒定及s1基因的進化分析對PEDV的防控具有重要意義。本研究從湖北某暴發仔豬腹瀉的豬場分離到一株PEDV并命名為HB201503，并對其s1基因進行了克隆測序。將測序結果與最近幾年NCBI登陸的PEDV毒株及疫苗株CV777的s1基因核苷酸序列進行了進化分析，旨在為豬流行性腹瀉的防控及免疫機理的研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α感受態細胞購至康為世紀科技生物有限公司；pET-30A（+）載體、PEDV檢測引物參照文獻[6]合成；Vero 86細胞由湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所獸醫團隊保存。

1.2 主要試劑

AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量制備試劑盒購自康寧生命科學有限公司，One-step RT-PCR Super Mix購自北京全式金生物科技有限公司，膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒均購自康為世紀科技生物有限公司，同源重組酶購自南京唯贊生物科技有限公司，BamH I和Hind Ⅲ快切酶均購自TaKaRa公司，胰蛋白示磷酸鹽肉湯（Tryptose Phosphate Broth）購自上海浩然生物技術有限公司，氨芐青霉素（Amp）、鏈霉素（Kan）、DMEM培養基、胎牛血清（FBS）、胰酶均購自Invitrogen公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 細胞培養 采用DMEM培養基（100 U/mL氨芐青霉素，100 μg/mL鏈霉素，5%FBS）對Vero 86細胞進行培養，培養條件為37 ℃，5%CO2。

1.3.2 病毒分離 采集湖北某豬場腹瀉仔豬小腸及內容物加入5倍體積的生理鹽水后進行組織勻漿并用0.22 μm微孔濾膜過濾后參照文獻[7]中的PEDV分離方法進行病毒分離，具體為：將長滿單層Vero 86細胞的6孔板利用PBS緩沖液（不含鎂離子和鈣離子）洗滌兩遍后每孔加入500 μL處理好的病毒懸液，37 ℃、5%CO2條件下孵育30 min，每孔中加入2 mL的DMEM（100 U/mL氨芐青霉素，100 μg/mL鏈霉素，0.3%TPB）及10 μg/mL的胰酶2 mL。當80%以上細胞出現細胞病變時反復凍融收集病毒懸液。將病毒懸液繼續按上述方法接種于Vero上，連續傳代3次后對出現細胞病變的陽性孔進行PCR檢測。

1.3.3 引物設計 根據GenBank 上近幾年登陸的PEDV毒株的基因序列，利用DNAman比對序列后在s1基因序列兩邊的保守區域利用Primer 5.0設計了一對擴增s1基因序列全長的同源重組引物。引物序列為：上游引物F：5′-GCCATGGCTGATATCGGATCCTCTAATCATTTGGTCAACGTA-3′，下游引物 R：5′-CTCGAGTGCGGCAAGCTTCATTACAAACATA

TGTAACG-3'；檢測引物序列為：上游P1：5′-TTCGGTTCTATTCCCGTTGATG-3′，下游P2：5′-CCCATGAAGCACTTTCTCACTATC-3′。

1.3.4 RNA 提取 對采集的疑似感染PEDV病料加入5倍體積的生理鹽水后進行組織勻漿并反復凍融3次，然后取上清按照說明書進行RNA提取。對于傳代3次后且出現細胞病變的細胞，利用移液器將其懸浮后反復凍融3次，離心取上清后按照AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量制備試劑盒說明書提取RNA。

1.3.5 s1基因擴增 以提取的RNA為模板利用全式金One-step RT-PCR Super Mix對s1基因進行擴增。具體反應體系如下：RNA模板5 μL，上、下游引物各1 μL，2×One-step Reaction Mix 25 μL，One-step Enzyme Mix 1 μL，RNase-free water 17 μL。一步法反應條件如下：45 ℃反轉錄30 min；94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性1 min，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸150 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。檢測引物擴增體系與s1基因全長擴增體系一樣；反應條件為退火溫度55 ℃，延伸時間60 s，其余條件與s1基因全長擴增條件一致。反應結束后取5 μL PCR產物進行瓊脂糖電泳檢測，其余產物用于膠回收。

1.3.6 s1基因克隆 依照膠回收試劑盒說明書對擴增s1片段進行回收，參照Clone Express II one step kit 說明書將s1片段連接到pET-30A（+）載體上，然后將重組質粒轉化到DH5α并挑取單菌落進行擴大培養并抽提質粒進行酶切鑒定，對陽性的重組質粒進行測序。

1.3.7 s1基因序列分析 將測序結果利用DNAman生物軟件進行拼接后，再利用DNAStar軟件對HB201503毒株的s1核酸序列與近幾年國內外流行的PEDV毒株（表1）和疫苗株CV777的s1核酸序列進行序列分析。利用MEGA6.0對s1核酸序列做系統進化分析。最后根據進化樹結果選擇代表性毒株對其s1基因氨基酸推導序列進行比對分析。

2 結果與分析

2.1 病毒分離結果

將連續傳代3次后出現細胞病變的細胞毒樣品收集，提取RNA后，利用PEDV檢測引物對樣品進行檢測，RT-PCR電泳結果（圖1）顯示樣品可擴增到663 bp大小的目標片段，即分離得到一株PEDV，命名為HB201503。

2.2 s1基因克隆

以PEDV陽性細胞毒中提取的RNA為模板，利用設計的s1基因全長引物進行RT-PCR擴增，結果出現2.4 kb左右的目的條帶（圖2）。將產物回收用同源重組克隆至pET-30A（+）載體上，提取質粒，用BamH I和Hind Ⅲ做雙酶切鑒定，電泳結果（圖3）顯示分別在2.4 kb和5.2 kb左右出現條帶。

2.3 s1基因序列分析

將s1基因測序結果拼接后與疫苗毒株CV777及近幾年在GenBank上登陸的部分PEDV毒株進行比較分析，發現HB201503與其他毒株s1基因相似性在91.4%～99.2%，其中HB201503與KM406183（2014）相似性最高，為99.2%，與日本毒株AB548624（2010）相似性最低，為91.4%，與經典毒株CV777相似性較低，為91.8%（圖4）。

2.4 s1基因進化分析

將HB201503株的s1核苷酸序列與表1中列舉的核苷酸序列以MEGA6.0軟件中的最大似然法構建系統進化樹（圖5），結果顯示PEDV主要被分為兩個亞群。HB201503位于第I個亞群，與KM406183（2014，四川）和KM609206（2015，江蘇）親源關系較近。國內外近幾年在NCBI登陸的毒株主要集中在第I個亞群，而疫苗毒株CV777在第II個亞群。

2.5 S1蛋白氨基酸序列分析

依據上述構建的系統發育樹，選取JQ979291、KF177258、KJ646591、KM189366、CV777等各分支的代表序列，推導其S1蛋白的氨基酸序列并進行蛋白質序列比對，結果（圖6）顯示其變異位置主要發生在55-74、157-163、270-283這三個位置。CV777與HB201503及近幾年分離的其他毒株在55-74、157-163位氨基酸出現了連續4個以上氨基酸替換或缺失。HB201503與CV777及近幾年分離的其他毒株比較，還在270-283位氨基酸出現了1個氨基酸缺失和10個氨基酸的替換。

3 小結與討論

國內目前應用于防控PED的疫苗主要是通過將CV777毒株在Vero細胞上傳代125代后獲得了CV777弱毒株后，在此基礎上研發而成的弱毒苗[8]。但近年來國內出現在免疫疫苗后仍然暴發PED的情況，這提示毒株有發生變異的可能。纖突蛋白基因（s）是PEDV結構蛋白中最大的基因，是誘導機體產生免疫性中和抗體的主要免疫蛋白基因[9]，其中S蛋白的S1亞基包含了PEDV主要的中和抗原位點[10]。

本研究通過對HB201503、CV777以及近幾年在NCBI上登陸的PEDV s1基因序列進行比較分析，發現近幾年的分離株包括HB201503與疫苗株的s1核苷酸序列相似性均較低，這提示毒株發生了一定程度上的變異。從進化樹分析結果來看，國內近幾年分離到的毒株與美國、韓國等國家近年分離到的毒株被類聚到一個亞群，而這些國家近年來都暴發流行過PED，提示毒株的變異可能造成了病毒毒力的改變或抗原性的改變。本研究根據s1基因系統進化樹，將HB201503、CV777及其他一些具有代表性的毒株的s1基因推導氨基酸序列做分析比對，發現CV777與HB201503及近幾年分離的其他毒株在55-74、157-163位氨基酸出現了連續4個以上氨基酸替換或缺失，而HB201503與CV777及近幾年分離的其他毒株比較，還在270-283位氨基酸出現了1個氨基酸的缺失和10個氨基酸的替換。目前相關研究證明S1蛋白氨基酸在248-280區域是一個能和PEDV顆粒具有高親和力的表位序列[10]。它出現連續氨基酸的替換可能是導致免疫失敗的一個原因。與疫苗株CV777相比，近年來在NCBI登陸的其他毒株S1蛋白氨基酸序列在55-74出現連續4個氨基酸缺失、在157-163位點出現連續5個氨基酸替換對PEDV在生物學意義上有何影響，還有待進一步研究。

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