清心Ⅱ號對病毒性心肌炎心肌纖維化內皮素1及轉化生長因子β1表達的干預作用

劉旺 王娟 徐百鴻 程志清

[摘要] 目的 研究清心Ⅱ號對病毒性心肌炎心肌纖維化內皮素1（ET-1）及轉化生長因子β1（TGF-β1）表達的干預及抗病毒作用。 方法 150只清潔級體重14～16 g健康雄性BALB/c小鼠，采用隨機數字表法分出10只作為正常組；其余140只作為造模組，采用腹腔注射含不同濃度柯薩奇病毒B3（CVB3）半數組織培養感染劑量為10-5的病毒液3次，每次每只2 mL，首次1∶2000濃度CVB3病毒液，2周后腹腔接種1∶1600濃度CVB3病毒液，4周后腹腔注射1∶800濃度CVB3病毒液。60 d后模型構建成功，存活小鼠94只。隨機選取90只，分為清心Ⅱ號高、中、低劑量組各20只，卡托普利組20只，模型組10只。正常組和模型組給予生理鹽水灌胃，治療組分別給予卡托普利和清心Ⅱ號高、中、低劑量灌胃。實驗結束后頸椎脫臼法處死動物，采集心臟組織液氮速凍。分別應用免疫組化方法檢測TGF-β1含量，放免法檢測各組血漿ET-1含量，RT-PCR技術檢測CVB3 RNA，VG染色觀察各組纖維化形成情況，并檢測膠原陽性面積占測量面積的百分比，即容積分數。 結果 VG染色后正常組含少量膠原纖維，分布于血管周圍；模型組心肌細胞排列紊亂，膠原纖維含量與正常組比較增生明顯（P < 0.05）；TGF-β1、ET-1、CVB3 RNA模型組及各治療組均高于正常組（P < 0.05）；治療后各治療組膠原纖維較模型組減少（P < 0.05），清心Ⅱ號各治療組隨劑量增加膠原纖維逐漸減少；各治療組TGF-β1、ET-1、CVB3 RNA與模型組比較均相應減低（P < 0.05），清心Ⅱ號高劑量組TGF-β1與正常組比較，差異無統計學意義（P > 0.05）；對減少ET-1，清心Ⅱ號高劑量組與卡托普利組療效相當（P > 0.05）。 結論 血漿ET-1與TGF-β1在病毒性心肌炎心肌纖維化形成過程中發揮重要作用，清心Ⅱ號具有抗病毒、抗心肌纖維化作用。

[關鍵詞] 內皮素1；轉化生長因子β1；病毒基因檢測；VG染色；心肌纖維化

[中圖分類號] R285 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）02（c）-0009-05

Intervention effect of qinxin Ⅱ recipe on expression of ET-1 and TGF-β1 in mouse of viral myocarditis myocardial fibrosis

LIU Wang1 WANG Juan2 XU Baihong3 CHENG Zhiqing4

1.Department of General， Tumor Hospital of Hangzhou， Zhejiang Province， Hangzhou 310003， China； 2.Department of Infection， Children's Hospital of Hangzhou， Zhejiang Province， Hangzhou 310014， China； 3.Department of Cardiology， Puyang Hospital of Traditional Chinese Medicine， He′nan Province， Puyang 457001， China； 4.College of Basic Medicine， Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine， Zhejiang Province， Hangzhou 310053， China

[Abstract] Objective To study intervention effect of qinxin Ⅱ recipe on expression of endothelin-1 （ET-1） and transforming growth factor-β1 （TGF-β1） in mouse of viral myocarditis myocardial fibrosis and ant-virus effect. Methods The 150 health male BALB/c mice （weight： 14-16 g） were randomly allotted into two groups： the normal group （n=10） and the model constructed group （n=140）. The mice of the model constructed group were injected coxsackie virus B3 （CVB3） of median tissue culture infectious dose 10-5 poison by intraperitoneal. 2 mL CVB3 poison was injected by intraperitoneal for each mouse， repeating three times. The injected concentration and time were as following： 1：2000 of CVB3 at beginning， 1：1600 of CVB3 after two weeks and 1：800 of CVB3 4 weeks later. The model was constructed successfully after 60 days and 94 mice were live. 90 mice were selected randomly from 94 mice for following three groups： model group （n=10） and captopril group （n=20） and qinxin Ⅱ （high， medium and low dose） groups （20 mice in each group）. The normal group and model group were fed normal saline by gavage， treatment groups were fed captopril and qinxin Ⅱ groups （high， medium and low dose）， respectively. The mice were killed by cervical dislocation after experiment， heart tissue was collected and snap-frozen in liquid nitrogen. TGF-β1 and ET-1 contents in heart were detected using immunohistochemical method and radioimmunoassay， respectively； CVB3 RNA was assayed by RT-PCR； Fibrosis formation was observed by VG staining and percentage of positive area （volume fraction） of collagen was also detected. Results The results showed that collagen fiber in heart of mice in the normal group was detected by VG staining， distributing around the blood vessels； arrangement of myocardial cell in heart disorder in model group and collagen fiber in heart of mice in the model group was significant hyperplasia compared with those of normal group （P < 0.05）. TGF-β1， ET-1 and CVB3 RNA in heart of each treatment group and model group were all higher than those of the normal group （P < 0.05）. After treatment， the collagen fiber in heart of all treatment groups was lower than model group （P < 0.05）， and with increasing dose of qingxin Ⅱ， the collagen fiber in heart of treatment group was decreased gradually. TGF-β1， ET-1 and CVB3 RNA in heart of treatment group cured by qingxin Ⅱ recipe were reduced compared to model group. TGF-β1 in heart of high qingxin Ⅱ recipe almost was close to normal group， there was no statistically significant difference （P > 0.05）. For reducing ET-1， curative effect of high qingxin Ⅱ recipe group was almost same to captopril group （P > 0.05）. Conclusion ET-1 and TGF-β1 of plasma play an important role in process of viral myocarditis myocardial fibrosis， and qingxin Ⅱ may have a role in anti-virus and anti-myocardial fibrosis.

[Key words] ET-1； TGF-β1； Virus gene detection； VG staining； Myocardial fibrosis

病毒性心肌炎是臨床常見病、多發病。近年來發病率有增高趨勢，很多患者由于癥狀不典型未引起重視，且由于本病為病毒性疾病，西醫目前無特效抗病毒藥物，因而無特效療法，所以導致患者長期得不到有效治療，經久不愈，給患者的生活以及精神帶來極大的痛苦。病毒性心肌炎慢性期心肌纖維化是該疾病的晚期病理特征，表現為擴張型心肌病，可出現心律失常、頑固性心衰、心源性猝死等。因而，預防和控制病毒性心肌炎及心肌纖維化顯得尤為重要，本研究從內皮素1（Endothelin-1，ET-1）及轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）角度探析病毒性心肌炎心肌纖維化形成機制及清心Ⅱ號干預作用。

1 對象與方法

1.1 實驗動物

清潔級體重14～16 g，4周齡，雄性健康BALB/c小鼠，購自于中國科學院上海實驗動物中心，浙江中醫藥大學動物實驗中心飼養，動物質量合格證號：SCXK（滬）2003-0003，飼養于清潔動物房內，動物飼養設施條件合格證：SYXK（浙）2003-0003。溫度20～25℃，相對濕度45%～70%，光照明暗各12 h，換氣次數20 次/h；動物實驗設施條件合格證：SYXK（浙）2003-0003。動物飲水為城市自來水，用凈水器濾過后裝入消毒后的飲水瓶內自由飲用，標準飼料喂養。

1.2 主要試劑及設備

石蠟切片機，MICROW HM34OE德國；熒光顯微鏡攝像機，日本OLYMPUS BX60型；BMJ-Ⅲ型包埋機及冷凍臺，江蘇；GNP-9080型隔水式恒溫培養箱，上海精宏實驗設備有限公司；抗體稀釋液，北京中山生物有限公司；VITEK比色計，美國HACH公司；瓊脂糖，上海Sangon生物工程技術公司；放免試劑盒，寶信生物科技有限公司；PCR試劑盒，大連寶生物工程有限公司；DL 2000 Marker，大連寶生物工程有限公司；5×TBE：Tris 54 g，硼酸27.5 g，0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）200 mL溴化乙錠溶液（EB），濃度為10 mg/mL PCR合成儀，美國MJ Research；PTC-200。

1.3 實驗用病毒及藥物

柯薩奇病毒B3（CVB3）（Nancy株，TCID），復旦大學中山醫院病毒性心肌病重點實驗室惠贈，保存于-70℃低溫冰箱備用。清心Ⅱ號由人參、丹參、苦參組成，浙江中醫藥大學藥學院制劑室水煎醇提噴霧干燥后分高、中、低3種劑量，高劑量每毫升含生藥為3 g，中劑量每毫升含生藥2 g，低劑量每毫升含生藥1 g。卡托普利片為上海施貴寶制藥有限公司生產，批準文號為國藥準字H44020747。PCR引物均由上海Sangon生物工程技術公司合成，Trizol及逆轉錄試劑盒購于上海Sangon生物工程技術公司。

1.4 模型復制

150只健康雄性BALB/c小鼠，采用隨機數字表法分出10只作為正常對照組，參照以往模型復制方法[1]，腹腔注射不含病毒的Eagle液，接種時間、次數同其余140只造模組。其余140只腹腔注射含不同濃度CVB3半數組織培養感染量（TCID50）=10-5的病毒液3次，每次每只2 mL，首次1∶2000，2周后腹腔接種1∶1600濃度CVB3病毒液，4周后腹腔注射1∶800濃度CVB3病毒液，60 d后模型成功。

1.5造模成功后分組

采用隨機數字表法選取90只存活小鼠，分為模型組10只，卡托普利組20只，清心Ⅱ號高、中、低劑量組分別為20只。

1.6 治療方法

正常組、模型組給予生理鹽水2 mL/（次·d）灌胃，卡托普利組予卡托普利45 mg/kg灌胃，清心Ⅱ號高、中、低劑量分別予30、20、10 g/kg，每日1次、療程45 d。

1.7 觀察指標及檢測方法

1.7.1 心臟組織石蠟切片 治療結束后，將動物活殺斷頭取心臟，用濾紙吸干血跡后，將右心室和室間隔部置于液氮中，用作CVB3基因檢測，其余部分立即放在10%中性福爾馬林緩沖液（pH 7.4）中固定，石蠟包埋后連續切為4 μm厚之切片，60～62℃烘箱烤片后VG染色。

1.7.2 VG染色 二甲苯脫蠟20 min×2次；無水乙醇、95%、80%、70%乙醇、自然水水化；Weigert蘇木精染液5 min，流水洗；1%鹽酸酒精分化數秒，流水沖洗、藍化；用Van Gieson染液1～2 min；傾去染液直接用95%乙醇分化脫水；無水乙醇直接分化，脫水；二甲苯透明，封片。200倍鏡下觀察各組纖維化形成情況，并檢測膠原陽性面積占測量面積的百分比，即容積分數。VG染色試劑盒購于Maxin-Bio companyCat No.MST-8001 LOT：510208001。

1.7.3 TGF-β1免疫組化檢測 石蠟切片后脫蠟至水，抗原修復，3%雙氧水阻斷內源性過氧化物酶10 min，PBS清洗，滴加一抗、二抗；37.0℃孵育40 min；DAB顯色（Fibronectin為AEC顯色，陽性呈紅色），封片。以PBS代替一抗作空白對照。

1.7.4 放免法對血漿ET-1檢測 動物摘眼球取血后分離血漿，加入標準品、樣品及抗體后混勻，4℃孵育16 h，加入125I混勻，4℃孵育16 h；加入GAR和NRS混勻，室溫孵育90 min，再加緩沖液混勻，離心20 min后吸取上清液，讀數、推算結果。

1.7.5 RT-PCR檢測CVB3 RNA水平 總RNA提取、鑒定：Trizol一步法抽提取心肌組織100 mg加1 mL Trizol勻漿混勻，加氯仿0.2 mL，再混勻，在4℃下離心12 000 r/min，15 min后轉上層液400 μL到另一1.5 mL EP管中，加入異丙醇400 μL混勻，12 000 r/min，離心10 min后棄上清，加入用焦碳酸二乙酯（DEPC）水配且預冷后的75%乙醇1 mL，4℃情況下7500 r/min再離心5 min后棄上清，干燥5～10 min，溶于DEPC水中至20 μL（10～20 μL）。PCR反應條件：CoxsackieB3病毒95℃預變性5 min，94℃變性25 min，58℃退火35 min，72℃延伸15 s，72℃ 7 min終末延伸，35個循環，4℃保溫。GAPDH：95℃ 5 min預變性，94℃變性30 s，60℃退火20 s，72℃ 30 s延伸，72℃ 7 min終末延伸。CoxsackieB3序列，5'端序列：TAACACACAC-CGATCAACAG，3'端序列：ATGGCCAATCCAATAACTAT，擴增產物長度522 bp；GAPDH，5'端序列：GAGGCCGG TGCTGAGT ATGT，3'端序列：CTTCTGG-GTGGCAGTGATGG，擴增產物長度294 bp。P-ERK1， 5'端序列：CTACGATCCGACAGATGGC，3'端序列：GAAGCA GCAAGGGCGTTA，擴增產物長度644 bp；GAPDH序列，5'端序列：TTCTTTGCA GCTCCTTCG，3'端序列：TCTCCATGTCGTCCCAGT擴增產物長度為298 bp。PCR反應產物的灰度定量分析：PCR擴增產物以基因GAPDH序列作為內參照，經瓊脂糖凝膠電泳后，將電泳結果使用英國Syngene成像分析系統掃描分析灰度值，對陽性電泳條帶進行吸光度峰值下面積積分，每一樣本以CVB3、P-ERK和GAPDH條帶灰度值比值作為樣本量。

1.8 統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

在造模過程中，正常組BALB/c小鼠表現機警，反應快，皮毛致密整齊，有光澤，活動正常，飲食無異常，體重增長較快，無死亡。造模組腹腔注射病毒后從第4天開始出現死亡，存活小鼠精神不振，反應遲鈍，皮毛無光澤，飲食減少，消瘦，活動減少，皮溫降低，肛門墜糞，7～10 d以后死亡減少，皮毛漸轉光澤，活動增多，皮溫上升，但有少數小鼠出現煩躁不安，噬咬其他小鼠，1個月后幾乎無死亡，造模期間共死亡46只。在治療過程中，小鼠食量漸增，皮毛光澤度較前有改善，活動度增加，清心Ⅱ號高、中劑量及卡托普利組改善較明顯，低劑量組皮毛光澤度改善較高中劑量及卡托普利組差。正常組治療期間無死亡，模型組、卡托普利組、清心Ⅱ號高劑量組、清心Ⅱ號中劑量組、清心Ⅱ號低劑量組在治療過程中分別死亡1、2、4、7只。

2.2 心肌纖維化觀察

模型組血清膠原含量明顯高于正常組，差異有高度統計學意義（P < 0.01）；卡托普利組、清心Ⅱ號高劑量組、清心Ⅱ號中劑量組血清膠原含量與模型組比較，差異均有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）；而清心Ⅱ號低劑量組與模型組比較，差異無統計學意義（P > 0.05），見表1。從圖1可見，VG染色后心肌細胞呈黃色，膠原纖維呈紅色，正常組含少量紅色膠原纖維，分布于血管周圍，模型組細胞紅色染色較多，提示膠原纖維增生明顯。模型組心肌細胞排列紊亂，血清膠原含量較高，而卡托普利組及清心Ⅱ號各治療組紅色染色減少，變淡，血清膠原含量較少，且清心Ⅱ號各治療組隨劑量增加紅色范圍逐漸減少，顏色逐漸變淡，亦即心肌細胞纖維化逐漸減輕。

A：正常組；B：模型組C：卡托普利組；D：高劑量組；E：中劑量組；F：低劑量組

圖1 各組心肌纖維化情況（VG染色，200×）

表1 各組小鼠血清膠原含量（x±s）

注：與正常組比較，*P < 0.01；與模型組比較，#P < 0.05，##P < 0.05

2.3 心肌ET-1、TGF-β1表達及CVB3 RNA檢測結果

造模后模型組TGF-β1、ET-1、CVB3 RNA均高于正常組，差異均有統計學意義（P < 0.05），治療后各組TGF-β1、ET-1、CVB3 RNA均較模型組降低，差異均有統計學意義（P < 0.05），清心Ⅱ號高劑量組TGF-β1接近于正常組（P > 0.05）；對于減少ET-1，清心Ⅱ號高劑量組與卡托普利組療效相當（P > 0.05），而清心Ⅱ號中、低劑量組較卡托普利組療效差（P < 0.05）。見表2。

3 討論

病毒性心肌炎是一種以柯薩奇病毒感染為主的局限性或彌漫性心肌炎癥性疾病，慢性期導致心肌纖維化，其形成心肌纖維化的機制尚不十分清楚，一般認為是病毒的直接損傷、局部炎癥及自身免疫，釋放多種細胞因子，導致炎性細胞浸潤，心肌細胞壞死、纖維修復，膠原合成和降解失衡[2]，特別是TGF-β1能誘導膠原、蛋白聚糖等細胞外間質成分合成，促進心肌纖維化[3-4]，并且TGF-β1基因和蛋白表達水平與心肌纖維化指數呈正相關[5]。有學者認為，TGF-β1可通過多種信號轉導途徑，如Smads、蛋白激酶C（PKC）、細胞外信號調節激酶（MEK）、小分子G蛋白（Rho）及Rho相關激酶（Rho/Rock）信號通路，激活結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）[6-9]，而CTGF可促進成纖維細胞增殖、膠原分泌[10]。

ET-1是主要由血管內皮細胞產生的、作用極強的縮血管活性多肽，在心肌成纖維細胞表達較強，可使心肌成纖維細胞合成膠原蛋白增加[11]。ET-1通過與內皮素A型受體（endothelin receptor typeA，ET-AR）結合促進心肌細胞肥大與增生[12]。TGF-β1與ET-1之間內在聯系，尚不完全清楚，目前已知ET-1是CTGF的上游因子[13]，ET-1會刺激多種細胞通過MEK/ERK通路，用U0126可阻斷這一過程[14]，但在病毒性心肌炎心肌纖維化中鮮有報道。

病毒性心肌炎慢性期由于病毒DNA整合到心肌細胞內形成缺陷病毒，致毒邪內蘊，瘀血阻絡，耗傷氣陰。清心Ⅱ號由苦參、人參、丹參組成，苦參清熱解毒，人參益氣養陰，丹參活血化瘀，與病毒性心肌炎的病機相吻合。苦參既有抗柯莎奇病毒病保護心肌細胞的作用[15]，又通過抑制AngⅡ的水平、抗氧化以提高NO水平[16]，下調心肌組織中TGF-β1的表達以抑制心肌纖維化[17]。人參可通過增加心肌細胞干擾素達到抗病毒的作用[18]，通過下調TGF-β1、CTGF、ET-1降低心肌纖維化[19]。丹參有效成分丹參酮ⅡA可能通過抑制心肌同組基因蛋白A（RhoA）/ROCK信號通路，降低下游炎性細胞因子和促纖維化細胞因子分泌，從而減輕心肌纖維化[20]。

本實驗，經柯薩奇病毒B3多次腹腔注射復制慢性心肌炎心肌纖維化模型成功后，CVB3 RNA及TGF-β1、ET-1、膠原纖維均較對照組明顯增高（P < 0.05），心肌纖維化形成。治療后上述4項指標均減少，進一步證明清心Ⅱ號抗心肌纖維化與與抑制CVB3 RNA合成的直接抗病毒作用，從而從源頭掐斷炎癥所致心肌纖維化的成因，也揭示了ET-1、TGF-β1在病毒性心肌炎心肌纖維化成過程中起關鍵作用，其形成機制與Rho/Bock信號通路[8]、TGF-β-MAPK/ERK通路[9]及TGF-β-smads通路有關[21]，其抗心肌纖維化作用與清心Ⅱ號劑量有關，隨著劑量的增加抗心肌纖維化作用逐漸加強，心肌纖維化程度逐漸減輕，療效與卡托普利相當（P > 0.05），且清心Ⅱ號未發現干咳等卡托普利的副作用。清心Ⅱ號抗病毒作用亦明顯，顯示高、中劑量與卡托普利相當，但未見有卡托普利抗病毒作用報道，其機制不明，可能與卡托普利改善免疫機制有關，值得醫學界進一步研究。

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（收稿日期：2015-07-17 本文編輯：任 念）